Isolering og genom analyse af enkelte Virioner benytter "enkelt virus Genomics '
Summary
Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode til at isolere og amplificere genomer af enkelte vironer. Virale suspensioner af en blandet samling sorteres ved hjælp af flowcytometri på et objektglas med diskrete brønde indeholdende agarose, derved opfange virionet og reducere genom stabklipning under nedstrøms behandling. Hele genomet forstærkning opnås ved anvendelse af multiple forskydning forstærkning (MDA) resulterer i genomisk materiale, der er egnet til sekventering.
Abstract
Hele genomet amplifikation og sekventering af enkelte mikrobielle celler muliggør genomkarakterisering uden behov for dyrkning 1-3. Vira, som er allestedsnærværende og de mest talrige enheder på vores planet 4 og vigtigt i alle miljøer 5, er endnu ikke afsløret via lignende tiltag. Her beskriver vi en metode til at isolere og karakterisere genomer af enlige virioner kaldet 'enkelt virus Genomics' (SVG). SVG udnytter flowcytometri at isolere enkelte vira og hele genomet forstærkning for at opnå høj molekylvægt genomisk DNA (gDNA), der kan anvendes i efterfølgende sekventeringsreaktioner.
Protocol
Discussion
En række vigtige faktorer skal tages i betragtning, når de anvender SVG tilgange. Genotypebestemmelse, som blev udført under proof-of-concept eksperiment 13, er ikke en gyldig løsning for miljø eller ukendte isolater som bevarede primere ikke er tilgængelige på tværs af alle virale grupper. Desuden er baggrunden dna-syntese eller uspecifik forstærkning almindeligt rapporteret under opformering ved hjælp af MDA reaktionen 14.. Uspecifik amplifikation er blevet tilskrevet kontaminerende DNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Ken Nealson for hans indsigt og rådgivning under hele manuskriptet forberedelsesprocessen.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referências
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
