L'isolement et l'analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »
Summary
La génomique des virus simples (SVG) est une méthode pour isoler et d'amplifier le génome de virions isolés. Suspensions virales d'un assemblage mixte sont triées par cytométrie de flux sur une lame de microscope, avec des puits discrètes contenant l'agarose, capturant ainsi le virion, et la réduction de cisaillement du génome au cours du traitement en aval. Amplification du génome entier est obtenue en utilisant une amplification par déplacement multiple (MDA) résultant en matériel génomique qui est approprié pour le séquençage.
Abstract
Amplification du génome entier et le séquençage de cellules microbiennes simples permet une caractérisation génomique sans le besoin de la culture 1-3. Les virus, qui sont omniprésentes et les plus nombreuses entités de notre planète et 4 importante dans tous les environnements, 5 n'ont pas encore été révélé par des approches similaires. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et caractériser les génomes des virions single intitulé «Génomique de virus unique» (SVG). SVG utilise la cytométrie en flux pour isoler les virus individuels et amplification du génome entier pour obtenir un ADN génomique de haut poids moléculaire (ADNg) qui peut être utilisé dans des réactions de séquençage suivantes.
Protocol
Discussion
Un certain nombre de facteurs importants doivent être pris en considération lors de l'application d'approches SVG. Génotypage, comme cela a été effectué au cours de la preuve de concept de l'expérience 13, n'est pas une option valable pour les isolats environnementaux ou inconnus comme amorces conservées ne sont pas disponibles dans tous les groupes virales. Aussi, fond synthèse de l'ADN ou de l'amplification non spécifique est fréquemment rapportées lors de l'amplifica…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Ken Nealson pour sa perspicacité et conseils tout au long du processus de préparation du manuscrit.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referências
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
