Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando 'Genomics vírus simples'
Summary
Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a sequenciação.
Abstract
Amplificação e seqüenciamento do genoma inteiro das células microbianas individuais permite a caracterização genômica, sem a necessidade de cultivo 1-3. Os vírus, que são onipresentes e as mais numerosas entidades em nosso planeta 4 e importante em todos os ambientes 5, têm ainda a ser revelado através de abordagens semelhantes. Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar os genomas de virions single chamado 'Genomics Vírus único »(SVG). SVG utiliza a citometria de fluxo para isolar os vírus de amplificação individuais e todo o genoma para obter ADN genómico de elevado peso molecular (gDNA), que pode ser utilizado em reacções de sequenciação subsequentes.
Protocol
Discussion
Uma série de fatores importantes devem ser levados em consideração na aplicação de abordagens SVG. Genotipagem, que foi realizada durante o experimento prova-de-conceito 13, não é uma opção válida para os isolados ambientais ou desconhecidos como iniciadores conservados não estão disponíveis em todos os grupos virais. Além disso, a síntese de ADN de fundo, ou a amplificação não específica é comumente avaliado durante a amplificação usando a reacção do MDA 14. Amplificação …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Ken Nealson por sua visão e aconselhamento ao longo do processo de preparação do manuscrito.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referências
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
