Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode til at isolere og amplificere genomer af enkelte vironer. Virale suspensioner af en blandet samling sorteres ved hjælp af flowcytometri på et objektglas med diskrete brønde indeholdende agarose, derved opfange virionet og reducere genom stabklipning under nedstrøms behandling. Hele genomet forstærkning opnås ved anvendelse af multiple forskydning forstærkning (MDA) resulterer i genomisk materiale, der er egnet til sekventering.
Abstract
Hele genomet amplifikation og sekventering af enkelte mikrobielle celler muliggør genomkarakterisering uden behov for dyrkning 1-3. Vira, som er allestedsnærværende og de mest talrige enheder på vores planet 4 og vigtigt i alle miljøer 5, er endnu ikke afsløret via lignende tiltag. Her beskriver vi en metode til at isolere og karakterisere genomer af enlige virioner kaldet 'enkelt virus Genomics' (SVG). SVG udnytter flowcytometri at isolere enkelte vira og hele genomet forstærkning for at opnå høj molekylvægt genomisk DNA (gDNA), der kan anvendes i efterfølgende sekventeringsreaktioner.
Protocol
1.. Fremstilling af virale suspensioner Før isoleringen af de enkelte virioner via flowcytometri, forberede ufikserede virale suspensioner. Isoler virale partikler ved anvendelse af tidligere etablerede protokoller gør sikker endelig viral suspension er indeholdt i 0,1 um-filtreret TE (Tris-EDTA, pH 8). Vi anbefaler at bruge tangentielstrømningsfiltrering (TFF) nærmer 6 selv om andre metoder er blevet udviklet, at brugen kemisk flokkulering 7.. </li…
Discussion
En række vigtige faktorer skal tages i betragtning, når de anvender SVG tilgange. Genotypebestemmelse, som blev udført under proof-of-concept eksperiment 13, er ikke en gyldig løsning for miljø eller ukendte isolater som bevarede primere ikke er tilgængelige på tværs af alle virale grupper. Desuden er baggrunden dna-syntese eller uspecifik forstærkning almindeligt rapporteret under opformering ved hjælp af MDA reaktionen 14.. Uspecifik amplifikation er blevet tilskrevet kontaminerende DNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Ken Nealson for hans indsigt og rådgivning under hele manuskriptet forberedelsesprocessen.
Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).