Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Summary

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Abstract

Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) ^1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio.

BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de ^2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) ^{8, 9.} RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável ¹⁰ e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada ^11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos.

Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).

Protocol

1. Preparação de células

1. Experiências deve ser iniciada usando ex vivo populações de células-tronco cultivadas geneticamente modificadas para expressar as proteínas repórter da luciferase e EGFP. Aqui usamos luciferase / eGFP-expressam murinos derivadas da medula óssea (células estromais BMSC-Luc/eGFP) como anteriormente descrito por Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Dois dias antes de marcação celular, as células BMSC-Luc/eGFP em placas a uma densidade de 8 x 10 células por ⁵ T75 frasco de cultura em meio de expansão 15 ml completo (CEM) suplementado com 1 ug / ml Puromycine.
3. Permitir que as células a crescer durante....

Discussion

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de enxertos de células.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
IMDM	Lonza	BE12-722F	Componente do CEM meio de crescimento celular
Soro fetal de bovino	Gibco	10270-106	Componente do CEM meio de crescimento celular
De soro de cavalo	Gibco	1605-122	Componente do CEM meio de crescimento celular
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140	Componente do CEM meio de crescimento celular
Fungizone	Gibco	15290-018	Componente do CEM meio de crescimento celular
PBS	Gibco	14190
Puromycine	Invivogen	formiga-pr-1
tripsina	Gibco	25300
GB MPIO	Bangs Laboratories	ME04F/7833
D-luciferina	Promega	E1601
De cetamina (Ketalar)	Pfizer
Xilazina (Rompun)	Bayer Os cuidados de saúde
Isoflurano	Isoflo	05260-05
0,9% de solução de NaCl	Baxter
paraformaldeído	Merck	1.04005.1000
sacarose	Applichem	A1125
Micro-injecção de bomba	KD científica	KDS100
Photon imager	Biospace Lab
9.4T scanner de MR	Bruker BioSpin	Biospec 94/20 USR
BX51 microscópio	Olimpo	BX51
Mycrom HM criostato	Prosan	HM525
seringa	Hamilton	7635-01
Agulha de calibre 30	Hamilton	7762-03
Foto Visão software	Biospace Lab
M3vision software	Biospace Lab
Paravision software 5,1	Bruker BioSpin
Amira 4,0 software	Imagem Visage