Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים
Summary
מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.
Abstract
במהלך העשור האחרון, השתלת צברה עניין גובר כמו מודאליות טיפולית ראשונית או משנית עבור מגוון רחב של מחלות, הן במחקרים פרה קליניים. עם זאת, עד כה התוצאות לגבי תוצאה תפקודית ו / או התחדשות רקמות להשתלה הבאה לתאי גזע הם מגוונים למדי. באופן כללי, היתרון הקליני הוא ציין, ללא הבנה מעמיקה של המנגנון הבסיסי (ים) 1. לכן, מאמצים רבים הובילו לפיתוח שיטות שונות הדמיה מולקולרית כדי לפקח על תא גזע השתלת במטרה הסופית כדי להעריך באופן מדויק, הישרדות הגורל ופיזיולוגיה של בתאי גזע מורכבים ו / או סביבת המיקרו שלהם. השינויים שנצפו אחד או יותר פרמטרים שנקבעו על ידי הדמיה מולקולרית עשוי להיות קשור לאפקט קליני הנצפה. בהקשר זה, מחקרים שלנו להתמקד שימוש בשילוב של הדמיה ביולומינציה (BLI), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) ואת analysi היסטולוגיתזה להעריך השתלת תא גזע.
BLI נפוץ הלא פולשני לבצע מעקב תא ולפקח הישרדות התא בזמן בעקבות השתלת 2-7, בהתבסס על התגובה הביוכימית שבה תאים לבטא את הגן כתב בלוציפראז, מסוגלים לפלוט אינטראקציה הבאה אור עם המצע שלה (למשל D- luciferin) 8, 9. MRI לעומת זאת היא טכניקה לא פולשנית אשר ישים מבחינה קלינית 10 והוא יכול לשמש כדי לאתר במדויק שתלי סלולריים עם רזולוציה גבוהה מאוד 11-15, אם כי הרגישות שלה מאוד תלוי בניגוד שנוצר לאחר סימון התא עם חומר ניגוד MRI . לבסוף, ניתוח שלאחר המוות היסטולוגית היא השיטה של בחירה כדי לאמת את תוצאות המחקר שהתקבלו עם פולשנית טכניקות עם הרזולוציה הגבוהה ביותר וברגישות. יתר על כן הקצה נקודת ניתוח היסטולוגית מאפשר לנו לבצע ניתוח מפורט פנוטיפי של תאים מורכבים ו / או הרקמה שמסביב, תואר ראשוןsed על השימוש של חלבונים הכתב ניאון ו / או תיוג התא ישיר עם נוגדנים ספציפיים.
לסיכום, אנחנו כאן חזותית להדגים את complementarities של BLI, MRI ו היסטולוגיה לפענח תא גזע שונה ו / או בסביבה הקשורים המאפיינים הבאים השתלת תא גזע של מערכת העצבים המרכזית של עכברים. כך, למשל, מח עצם שמקורם בתאי סטרומה, מהונדסים גנטית כדי לבטא משופרת גרין פלורסנט חלבון (eGFP) ו גחלילית בלוציפראז (fLuc), ומסומן בכחול ניאון מיקרון בגודל חלקיקי תחמוצת ברזל (MPIOs), יהיו מורכבים ב מערכת העצבים המרכזית של המערכת החיסונית המוסמכות עכברים והתוצאות יהיה פיקוח על ידי BLI, MRI ו היסטולוגיה (איור 1).
Protocol
Discussion
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור שילוב של שלוש שיטות הדמיה משלימים (BLI, MRI ו היסטולוגיה) לאפיון מפורט של שתלים הסלולר את מערכת העצבים המרכזית של עכברים המוסמכות החיסונית. שילוב של תיוג כתב הגן של תאים, המבוססת על הנדסה גנטית עם גנים הכתב גחלילית בלוציפר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
Referências
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. . Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
- Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain’s innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
- Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
- De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
- Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
- Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
- Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
- Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
- Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
- Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
- Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
- Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
- Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
- Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
- Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
- Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
- Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
- Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
- Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
- Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
- Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
- Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
- Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
- Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
- Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
- Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
- Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).
