En trin-for-trin metode til at rekonstituere en ABC Transporter ind i Nanodisc lipidpartikler

Summary

Nanodiscs er små skiveformede partikler, der inkorporerer membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. Vi giver en visuel protokol, der viser trin for trin inkorporering af MalFGK2 transportør til en skive.

Abstract

Det nanodisc er en skiveformede partikel (~ 10-12 nm stor) at fælde membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. The nanodisc er en særlig attraktiv mulighed for at studere membranproteiner, specielt i forbindelse med ligand-receptor-interaktioner. Fremgangsmåden udviklet af Sligar og kolleger er baseret på de amfipatiske egenskaber af et manipuleret højt a-helisk scaffold protein fra apolipoprotein A1. De hydrofobe overflader af stillads-proteinet interagerer med fedtacyl sidekæder af lipiddobbeltlaget henviser polaregnene står det vandige miljø. Analyser af membranproteiner i nanodiscs har betydelige fordele i forhold liposom fordi partiklerne er små, ensartede og vandopløseligt. Endvidere kan biokemiske og biofysiske metoder normalt forbeholdt opløselige proteiner anvendes, og fra begge sider af membranen. I denne visuelle protokol, vi præsenterer en trin-for-trin rekonstituering af et godt kendetegnterized bakteriel ABC transportvirksomheden, mandlige-MalFGK _2-kompleks. Dannelsen af ​​skiven er en selvsamling proces, der afhænger af hydrofobe interaktioner, der finder sted ved den gradvise fjernelse af detergenten. Vi beskriver de væsentlige trin, og vi fremhæver betydningen af ​​at vælge en korrekt protein-til-lipidforhold for at begrænse dannelsen af ​​aggregater og større polydisperse liposom-lignende partikler. Simple kvalitetskontrol, såsom gelfiltreringschromatografi, nativ gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi sikre, at skiverne er blevet korrekt rekonstitueres.

Protocol

Samlet Rekonstitueringsprocessen Rekonstitueringen starter ved blanding af membranen scaffold protein (MSP) med det oprensede MalFGK 2-kompleks i nærvær af detergent-solubiliserede phospholipider. Trinnet efterfulgt af langsom fjernelse af detergenten med et adsorberende polystyren materiale kaldet Bio-Beads eller Amberlite (figur 1). Den automatiske montage proces sker sandsynligvis på grund af de apolære interaktioner mellem de hydrofobe phospholipider, d…

Discussion

Vi beskriver en enkel procedure til rekonstituering af maltose transportør i nanodiscs. Transportvirksomheden er ATPase aktiv og samspillet med det opløselige bindingspartner MalE kan genskabes (Figur 3). Den vellykkede rekonstituering af transportøren i nanodiscs bane vej for yderligere biofysiske og biokemiske analyser. Af særlig interesse vil være en systematisk analyse af Malk ATPase og maltose transport aktivitet i vaskemiddel, liposom og nanodiscs. ABC-transportører ændrer konformationer un…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.