Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.
De nanodisc is een schijfvormige deeltje (~ 10 tot 12 nm groot) die val membraaneiwitten in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. De nanodisc is zeer aantrekkelijk voor het bestuderen membraaneiwitten, met name in de context van ligand-receptor interacties. De methode ontwikkeld door Sligar en collega's is gebaseerd op de amfipatische eigenschappen van een sterk ontwikkelde a-helix scaffold eiwitten die afkomstig apolipoproteïne A1. De hydrofobe oppervlakken van de scaffold proteïne interactie met de vetacylgroepen zijketens van de lipide dubbellaag terwijl de poolgebieden maken het waterige milieu. Analyses van membraaneiwitten in nanodiscs duidelijk voordelen bieden liposoom omdat de deeltjes klein, homogeen en water oplosbaar. Bovendien kunnen biochemische en biofysische methoden gewoonlijk gereserveerd oplosbare eiwitten worden toegepast en aan beide zijden van het membraan. In deze visuele protocol we een stap-voor-stap reconstitutie van een goed tekensgekarakteriseerd bacteriële ABC transporter, de man-MalFGK 2 complex. De vorming van de schijf een zelf-assemblage proces dat afhangt van hydrofobe interacties die plaatsvinden tijdens de geleidelijke verwijdering van het detergens. We beschrijven de essentiële stappen en we wijzen op het belang van het kiezen van een juiste eiwit-lipide naar verhouding om de vorming van aggregaten en grotere polydisperse liposoom-achtige deeltjes te beperken. Eenvoudige kwaliteitscontroles zoals gelfiltratiechromatografie, native gel elektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie ervoor dat de schijven correct zijn opgelost.
We beschrijven een eenvoudige procedure voor de reconstructie van de maltose transporter in nanodiscs. De transporteur is ATPase actief en de interactie met de oplosbare bindingspartner MalE opnieuw kunnen worden (figuur 3). De succesvolle reconstructie van de vervoerder in nanodiscs opent de weg voor extra biofysische en biochemische analyse. Van bijzonder belang is de systematische analyse zijn de MÄLK ATPase en maltose transport activiteit in wasmiddel, liposoom en nanodiscs. ABC-transporters wijzig…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institute of Health Research. CSC werd gefinancierd door een postdoctoraal fellowship van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. FD is een Tier II Canada Research Chair.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|