NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l'incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.
Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l'étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d'une ingénierie très une hélice protéine extraite de l'échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d'échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l'environnement aqueux. L'analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l'eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d'autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d'un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe 2. La formation du disque est un processus d'auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l'élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l'importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d'agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.
Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l'interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l'analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D'un intérêt particulier sera l'analyse systématique de l'ATPase MalK et de l'activité de transport du maltose dans du dé…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Institut canadien de recherche en santé. SCC a été financé par une bourse de recherche postdoctorale en sciences naturelles et en génie du Canada. FD est une chaire de recherche du Canada.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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