Nanodiscs малых дисковидные частицы, которые включают мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Мы предоставляем визуальный протокол, который показывает, шаг за шагом включения MalFGK2 транспортера на диск.
Nanodisc является дисковидные частицы (~ 10-12 нм большой), что ловушка мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Nanodisc является особенно привлекательным вариантом для исследования мембранных белков, особенно в контексте лиганд-рецепторных взаимодействий. Метод пионером Sligar и коллегами основана на амфипатическими свойства разработаны высоко-спиральной эшафот белок, полученный из аполипопротеина A1. Гидрофобные лица белка эшафот взаимодействовать с ацил боковых цепей липидного бислоя в то время как полярные регионы сталкиваются с водной средой. Анализы мембранных белков в nanodiscs имеют значительные преимущества по сравнению с липосомами, поскольку частицы мелкие, однородные и растворимые в воде. Кроме того, биохимических и биофизических методов обычно зарезервированы для растворимых белков могут быть применены, и по обе стороны от мембраны. В этой визуальной протокол, мы представляем шаг за шагом, восстановление и характеристикиризуется бактериальных транспортеров ABC, мужчины MalFGK 2 комплекса. Формирование диска процесса самосборки, что зависит от гидрофобных взаимодействий, происходящих в ходе постепенного устранения моющего средства. Мы опишем основные шаги, и мы подчеркиваем важность выбора правильного белок-липидного соотношения для того, чтобы ограничить образование агрегатов и больше полидисперсных липосомы частицы. Простой контроля качества, такие как гель-фильтрации хроматографии, родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света убедиться, что диски были должным образом восстановлена.
Мы опишем простую процедуру для разведения мальтоза транспортера в nanodiscs. Транспортер АТФазы активного и взаимодействия с растворимым обязательного партнера-мужчины могут быть воссозданы (рис. 3). Успешное восстановление транспортера в nanodiscs открыть путь для дополнительного …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Канадский институт исследований в области здравоохранения. CSC была профинансирована докторской стипендии с естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады. FD является Tier II Канада заведующая кафедрой.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|