Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Summary

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

Abstract

RNAs não-codificantes longos são os reguladores de cromatina principais estados para processos biológicos importantes, como a compensação de dosagem, imprinting e expressão de genes de desenvolvimento ^{1,2,3,4,5,6,7.} A recente descoberta de milhares de lncRNAs em associação com os complexos de cromatina específicos de modificação, tal como o complexo Repressiva Polycomb 2 (PRC2) que medeia a histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), sugere as funções gerais para lncRNAs numerosos estados na gestão de cromatina em um gene específico moda ^8,9. Enquanto alguns lncRNAs são pensados ​​para trabalhar em cis em genes vizinhos, lncRNAs outros trabalhar em trans para regular genes localizados distantes. Por exemplo, Drosophila lncRNAs roX1 e roX2 regiões ligam numerosos no cromossomo X de células masculinas, e são críticas para a compensação de dosagem ^10,11. No entanto, as localizações exatas dos seus locais de ligação não são conhecidos em alta resolução. Da mesma forma, humana lncRNA hotair pode afectar PRC2 ocupação em hundreds de genes do genoma ^3,12,13, mas como especificidade o objectivo é claro. LncRNAs também pode servir como suportes modulares para recrutar o conjunto de complexos de proteínas múltiplas. O clássico trans-acting RNA andaime é o RNA TERC que serve como o modelo e andaime para a telomerase complexo ^14; hotair também pode servir como um andaime para PRC2 e um desmetilase H3K4 complexo ^13.

Estudos anteriores de mapeamento de ocupação de RNA em cromatina revelaram percepções substanciais ^15,16, mas apenas com um único locus do gene de cada vez. Os locais de ocupação da maioria dos lncRNAs não são conhecidos, e os papéis de lncRNAs na regulação da cromatina foram principalmente inferida a partir dos efeitos indiretos da perturbação lncRNA. Assim como imunoprecipitação de cromatina seguido por microarray ou seqüenciamento profunda (CHIP CHIP ou CHIP-seq, respectivamente) tem melhorado muito a nossa compreensão de interações DNA-proteína em escala genômica, aqui nós ilustrar um Recenqüentemente publicado estratégia para mapear ocupação RNA longo de todo o genoma em alta resolução ^17. Este método de isolamento, cromatina pela RNA Purificação (CHIRP) (Figura 1), baseia-se na captura de afinidade de alvo lncRNA: Complexo de cromatina por ladrilhos anti-sentido-oligos, que gera então um mapa de sítios de ligação genómicos com uma resolução de várias centenas de bases com sensibilidade elevada e baixa do fundo. CHIRP é aplicável a muitos lncRNAs porque o desenho de afinidade sondas é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento da estrutura do RNA ou domínios funcionais.

Protocol

1. Projeto Sonda Design DNA anti-senso de lado a lado sondas para a recuperação seletiva de RNA alvo por piar. Projeto sondas anti-senso oligo usando o designer sonda on-line em singlemoleculefish.com 18. Use esses parâmetros: número de sondas = 1 / sonda de 100 pb de comprimento RNA, 2) Alvo% GC = 45, comprimento Espaçamento 4) = 60-80; 3) Comprimento Oligonucleotide = 20. Quebre RNA em segmentos se muito tempo para o designer. Omitir regiões de repetições ou homologia extensa. Ordem sondas anti-senso de DNA com BiotinTEG em 3-primeiro-final. Sondas etiqueta de acordo com as suas posições ao longo do RNA. Separá-los em dois grupos para que a piscina ", mesmo" contém todas as sondas de numeração 2, 4, 6, etc, e na piscina "estranho" contém sondas de numeração 1, 3, 5, etc Diluir pool de sondas para concentração de 100 mM e armazenar a -20 ° C. Todas as experiências são para ser feita usandoambas as caixas, que servem como controles internos para o outro. Sinal dependente de ARN real estaria presente em ambos os pools, enquanto sonda específicas ruídos seria único para cada pool. Isto aplica-se tanto para CHIRP-qPCR e CHIRP-seq. 2. Células Colheita Recolher células que serão usados ​​para a experiência CHIRP. Crescer as células em placas de cultura de tecidos ou frascos até à confluência. Lavar com salina tamponada com fosfato (PBS) e uma vez trypsinize. Têmpera de tripsina com> volume 2x de mídia, pipeta cima e para baixo para retirar as células e ressuspender em suspensão de células individuais. Transferir todos os meios e as células ressuspensas em tubos de 50 ml Falcon. 20 milhões de células são tipicamente suficiente para uma amostra CHIRP. Girar em células 800RCF durante 4 min. Meios aspirado e ressuspender 40 milhões de células em 40 ml de PBS, combinar os tubos, se necessário. Girar em células 800RCF durante 4 min. Decantar PBS, aspirar cuidadosamente sobre um ângulo que o líquido restante. </ol> 3. Cross-link células e recolher pellet celular Crosslink coletadas células com glutaraldeído para preservar RNA-cromatina interações e preparar pellet celular. Execute todas as etapas à temperatura ambiente. Prepare glutaraldeído 1% em PBS à temperatura ambiente. Preparar 10 ml por 10 milhões de células (0,4 ml de caldo de glutaraldeído a 25% + 9,6 mL de PBS). O glutaraldeído deve ser utilizado fresco. Toque fundo de tubos Falcon de desalojar pelotas. Ressuspender o sedimento de células em glutaraldeído a 1%, começando com um pequeno volume para evitar pedaços, em seguida, o início até ao volume total. Inverta para misturar. Reticulação durante 10 min à temperatura ambiente num agitador de ponta a ponta ou rotador. Extingue-se a reacção de reticulação com um volume de 1/10th de 1,25 M de glicina, à temperatura ambiente durante 5 min. Girar em 2000RCF durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e lava-pelete com 20 mL de PBS gelado uma vez, girando a 2000RCF durante 5 min. Aspirar e ressuspender o wincinerada, reticulada pelete com 1 ml de PBS, refrigerada por 20 milhões de células. Transfira cada ml a um tubo Eppendorf e giram a 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Remover PBS, tanto quanto possível, com a ponta da pipeta com cuidado. Flash-congelar os peletes de células em azoto líquido e armazenada a -80 ° C indefinidamente. 4. Lise Celular Lisar células reticulados para preparar lisado celular. Descongelar sedimentos celulares congelados à temperatura ambiente. Toque difícil desalojar e misturar o pellet celular. Girar para baixo o sedimento em 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Use uma forte ponta da pipeta 10 ul para remover qualquer PBS restante. Em uma balança eletrônica (precisão de 1 mg) tara de um tubo de Eppendorf vazio (os nossos tubos de pesar 1.060 gramas muito consistente). Pese cada pellet e gravar o seu peso. Um prato centímetros completa 15 de células HeLa reticulados tipicamente pesa 100 mg. Tampão de Lise suplemento (massa 10X de pellet, por exemplo, 1 ml para 100 mg) com fresh inibidor da protease, PMSF e Superase-in (veja a lista de tampão em anexo). Misture bem. Adicionar 10X volume de Tampão de Lise completado, para cada tubo e ressuspender o sedimento. Para as pelotas pequenas <25 mg, ressuspender em 250 ul de tampão lise suplementado. suspensão deve ser suave. se não, dividir 500 alíquotas e usar uma motorizada pelete misturador para quebrar grumos. proceder imediato à sonicação. 5. sonicação dna cisalhamento por sonicando lisados ​​de células reticuladas. sonicar lisado celular bioruptor 15 tubos falcon ml. use <1,5 ml cada tubo, mais rapidamente sonicação, não do que dois vez. sonifique um banho água 4 ° c a alta definição com 30 segundos, 45 segundos off intervalos pulso. verifique min. continuar até o ligado é turvo. isso pode demorar tão pouco como minutos horas. númerode tubos, volume da amostra, temperatura banho, eo período tempo irá afectar processo leva. provavelmente taxas diferentes, modo juntam-los conjunto min redistribuir originais assegurar homogeneidade. nota: glutaraldeído-reticulado muito sonicate seus equivalentes formaldeído. quando transforma claro, transferir 5 novo tubo eppendorf. adicione 90 proteases k (pk) buffer (ver lista buffer) pk ul. vortex misturar girar rapidamente. incubar durante 50 c. extrair qiagen kit purificação pcr. eluir eluição (eb) verificar tamanho 1% gel agarose. grandes quantidades esfregaço 100-500 pb, está completa. sonicate. centrifugue as amostras sonicadas 16100rcf 10 combine sobrenadantes, 1 congelar-in flash nitroge líquidon. armazenar -80 6. chirp hibridizar sondas biotiniladas rna isolar cromatina ligada. descongelamento ambiente. preparar hibridação buffer, prepare 2 cromatina). vórtice misturar. amostra típico usando lisado, remover input adn local manter gelo posterior utilização. falcon. adicionar hibridização tubo. total ml, utilizar descongele nanodrop quantidade você tê-lo usado longo (100 im especificação ~ 500-600 ng > descreve o fluxo de trabalho piar. Uma experiência CHIRP bem sucedida tipicamente enriquece RNA alvo significativamente ao longo do não-específicos RNAs. A Figura 2 mostra o enriquecimento de humano telomerase RNA (TERC) a partir de células HeLa sobre GAPDH, um RNA abundantes celulares que serve como um controlo negativo. Maioria dos RNAs TERC (~ 88%) presentes na célula foram puxados para baixo através da realização de CHIRP, enquanto que apenas 0,46% de GAPDH RNA foi recuperado, demonstrando um factor de enriquecimento de ~ 200 vezes. Sondas inespecíficas, tais como sondas de segmentação LacZ RNA, que não se expressa em células de mamíferos (Figura 2), pode ser usado como adicionais controlos negativos. Regiões de ADN que se espera que se ligam a lncRNA alvo são tipicamente enriquecida ao longo de regiões negativas, quando medido por qPCR. A Figura 3 mostra qPCR validação de quatro hotair ligados a sítios em fibroblastos de prepúcio humanos primários que determinados através da realização de CHIRP-seq na mesma linha celular, enquanto TERC e GAPDH DNA sítios siRVE como regiões de controlo negativo. Tanto o "mesmo" ea sonda "estranha" define rendeu enriquecimento comparável de espera hotair ligados sites sobre regiões negativas, marca registrada dos verdadeiros lncRNA sítios de ligação. Alta capacidade de seqüenciamento de DNA CHIRP enriquecido produz um mapa global de lncRNA sítios de ligação. A Drosophila lncRNA roX2 é conhecido para interagir com o cromossoma X de uma maneira que é necessária para a compensação de dosagem. A Figura 4 mostra roX2 perfil de ligação ao longo de um secção do cromossoma X. Tanto o "mesmo" e "estranha" as amostras já foram seqüenciados e seus ruídos originais foram eliminados para produzir uma faixa de sinais que se sobrepõem. Cada "pico" aqui indica um site de forte roX2 vinculativo. A faixa completa ea lista de roX2 genes alvo têm sido descritas na Chu et ai. 2011 17. Figura Fluxograma 1. Do procedi CHIRPDure. Cromatina é reticulado para lncRNA: aductos de proteína in vivo biotinilados sondas azulejos são hibridizados para alvejar lncRNA, e os complexos de cromatina são purificados utilizando esferas de estreptavidina magnéticos, seguido por lavagens rigorosas.. Nós eluir lncRNA DNA ligado ou proteínas com um coquetel de RNase A e H. A seqüência lncRNA suposta ligação está esquematizado na laranja. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 Enriquece a Figura 2. Chirp para o homem TERC RNA. TERC-asDNA sondas recuperar ~ 88% de RNA celular TERC e GAPDH indetectável. LacZ-asDNA sondas são utilizados como controles negativos e recuperar nem RNAs. A média + dp são mostrados. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 Figura 3. Hotair CHIRP-qPCR em humano primário parafibroblastos Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 e ABCA2 são regiões que interagem com hotair. TERC e GAPDH serviram como controles negativos. A média + dp são mostrados. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 Figura 4. CHIRP-seq de dados de roX2 RNA em células de Drosophila SL2. "Mesmo" e "estranho" foram seqüenciados em separado; seus dados mesclar para refletir apenas picos comuns em ambos. A faixa fundida é mostrado. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17

Discussion

Aqui descrevemos CHIRP-seq, um método de mapeamento em sites in vivo lncRNA ligação do genoma. Os principais parâmetros para o sucesso são as piscinas de divisão de azulejos sondas de oligonucleotídeos e reticulação glutaraldeído. A concepção de sondas de afinidade é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento prévio da estrutura do RNA ou domínios funcionais. O nosso sucesso com roX2, TERC, e hotair – três RNAs bastante diferentes em duas espécies – sugere que CHIRP-seq provavelmente generalizáveis ​​para lncRNAs muitos. Tal como com todas as experiências, os controlos de cuidados e adequada são necessários para interpretar os resultados. LncRNA diferente pode exigir titulação de condições, ea mudança criteriosa de condições, tais como seleção de sondas diferentes de afinidade ou reticuladores, pode realçar diferentes aspectos da RNA-cromatina interações. Como ChIP seguintes, nem todos os eventos de ligação são, necessariamente, funcional, e estudos adicionais são necessários para verificar as conseqüências biológicas da RNA occupancy em cromatina. No entanto, prevemos muitas aplicações interessantes desta tecnologia para os pesquisadores de outros cromatina associados lncRNAs, cujo número agora na casa dos milhares ^8,9. Assim como ChIP-seq abriu a porta para a exploração do genoma de interações DNA-proteína, CHIRP-seq estudos do "RNA interactoma" pode revelar muitos novos caminhos da biologia.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026