Un modello murino della formazione muscolare da stimolazione elettrica neuromuscolare

Summary

Un modello murino di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES), una modalità sicuro ed economico clinica, ai muscoli compartimento anteriore viene descritto. Questo modello ha il vantaggio di modificare un dispositivo facilmente disponibile clinica allo scopo di elicitare contrazioni muscolari mirate e specifiche nei topi.

Abstract

Neuromuscolare stimolazione elettrica (NMES) è una modalità comune clinico che è ampiamente utilizzato per ripristinare ^{1, 2} mantenere o migliorare ^3-5 capacità funzionale del muscolo. Stimolazione transcutanea superficie del muscolo scheletrico prevede un flusso di corrente tra un catodo e un anodo, inducendo così l'eccitazione del gruppo motore e le fibre muscolari circostanti.

NMES è una modalità interessante per valutare la risposta del muscolo scheletrico di adattamento per diverse ragioni. In primo luogo, fornisce un modello riproducibile sperimentale in cui adattamenti fisiologici, come ad esempio hypertophy miofibre e il rafforzamento muscolare ^6, angiogenesi ^7-9, la secrezione di fattore di crescita ^9-11, e precursore di attivazione delle cellule muscolari ¹² sono ben documentati. Queste risposte fisiologiche possono essere attentamente titolata utilizzando diversi parametri di stimolazione (per la revisione Cochrane, vedi ^13). Inoltre, NMES recluteunità motorie non selettivo, ed in modo spazialmente e temporalmente fisso sincrono ^14, che offre il vantaggio di esercitare un effetto di trattamento su tutte le fibre, indipendentemente dal tipo di fibra. Anche se ci sono controindicazioni specifiche a NMES in popolazioni cliniche, incluse le patologie venose periferiche o neoplasie, ad esempio, NMES è sicura e fattibile, anche per coloro che sono malati e / o costretto a letto e per le popolazioni in cui l'esercizio rigoroso può essere impegnativo.

Qui, dimostriamo il protocollo di adattamento elettrodi disponibili in commercio ed eseguendo un protocollo NMES utilizzando un modello murino. Questo modello animale ha il vantaggio di utilizzare un dispositivo clinicamente disponibile e fornendo un feedback immediato per quanto riguarda il posizionamento dell'elettrodo di suscitare l'effetto desiderato muscolo contrattile. Ai fini della presente manoscritto, verrà descritto il protocollo per la stimolazione muscolare dei muscoli compartimento anteriore degli arti posteriori di un topo.

Protocol

1. Elettrodo Preparazione Tagliare un cm 1 x 1 sezione cm del circuito vettore. Stabilizzare 2 perni wirewrap utilizzando una morsa, con perni distanziati di circa 3,5 mm l'uno dall'altro. Le estremità biforcati dei perni deve essere rivolto verso l'alto. Piegare wirewrap perni ad un angolo di 90 °, circa a metà della loro lunghezza, con una pinza ad ago. Esporre i fili di rame di connettori, di circa 7 cm dal collegamento di piombo, mettendo a nudo l'isolamento del filo. Saldare uno dei fili di rame per la estremità biforcata di uno dei perni wirewrap. Ripetere il passaggio di saldatura per il perno wirewrap altro. Tirare termorestringente in connessione saldata tra i fili di rame e spille d'oro, al fine di isolare e stabilizzare. Riscaldare il tubo utilizzando la punta di saldatura. Inserire le punte non saldati dei perni wirewrap nelle aperture adiacenti del circuito basetta. Assicurarsi che i perni wirewrap sono parallele tra loro e stick attraverso la basetta in modo tale che le punte si trovano alla stessa distanza, quando sono immessi attraverso la scheda. Incorpora estremità saldati dei perni in resina epossidica trasparente. Lasciare che la resina catalizzi per circa 10 minuti, o fino a completa asciugatura. Ripetere l'applicazione di resina finché i perni e la scheda di vettore sono completamente incorporati per fornire integrità strutturale e serracavo per i cavi. Carteggiare epossidica utilizzando un file di metallo per esporre le punte dei perni oro. Utilizzare un multimetro per garantire che i due cavi non sono elettricamente corto e che i cavi hanno una continuità adeguata Collegare l'elettrodo conduce dal dispositivo NMES a femmina 2-way connettore del cavo (patch cord Pomona). 2. Preparazione degli animali Gli animali sono anestetizzati tramite inalazione utilizzando 2% isofluorano (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) in 100% O 2 gas. L'animale deve rimanere anestetizzati tutta tha NMES sessione. Prima di iniziare il protocollo NMES eseguire una presa punta per garantire che l'animale è anestetizzato completamente. Animale deve essere controllata regolarmente per la risposta alla stimolazione in modo da assicurare il livello di anestetico è sufficiente. L'anestesia deve essere regolata in base alle esigenze. Movimento diversa da quella della gamba stimolata, variazioni di profondità respiratoria, e il colore delle mucose dovrebbero essere valutati per monitorare regolarmente profondità di anestesia. Posizionare l'animale in decubito laterale. Applicare il lubrificante oftalmico agli occhi, al fine di impedire l'essiccamento della cornea durante la procedura. Radere l'area arti posteriori da trattare, e pulire con alcool. Pulire l'elettrodo con il 3% di candeggina, poi risciacquare con acqua. Applicare uno strato di gel conduttivo sul luogo dove l'elettrodo viene applicato. Riapplicare se necessario durante il protocollo NMES per garantire un flusso di corrente tra l'elettrodo e la pelle. Una lampada riscaldante or coperta di acqua circolante dovrebbe essere usata per mantenere i normali intervalli di base del corpo. Nota: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dalla University of Pittsburgh Institutional Animal Care e il Comitato Usa e si esibisce in PHS assicurati ed AAALAC Int. programma accreditato e servizi. 3. Stimolazione Posizionamento degli elettrodi per: Per la stimolazione dei muscoli del compartimento anteriore, tra cui il tibiale anteriore e il muscolo estensore lungo delle dita, posizionare l'elettrodo superficie direttamente sul nervo profondo peroneale dell'animale, che è un ramo distale off del nervo peroneo comune, e si trova appena anteriormente al l' testa del perone. Per la stimolazione dei muscoli del compartimento anteriore, il posizionamento dell'elettrodo viene confermata quando la stimolazione provoca la flessione dorsale della caviglia e la piena estensione completa delle cifre. D'altra parte, dorsiflessione, in assenza di estensione cifra indica che solo il tibiale anteriore del muscolo viene stimolato. Tale risposta contrattile mirata può essere auspicabile, a seconda del modello di studio. La contrazione del muscolo si divide in 2 fasi di stimolazione: un libero mobile, fase concentrica, che si verifica durante la fase iniziale ~ 0,5 secondi. Durante questa prima fase, la zampa si sposta da una posizione di riposo alla massima dorsiflessione ed estensione cifra. La seconda fase della stimolazione è una contrazione isometrica sostenuta alla fine del campo di dorsiflessione e l'estensione cifra. Stimolazione parametri: Questo modello utilizza il NMES PV 300 Empi elettroterapia dispositivo multifunzione, che offre 2 canali di NMES convenzionali (vedi tabella). Ai fini di questo modello, solo 1 canale viene utilizzato. Parametri utilizzati includono simmetrica forma d'onda, una durata di impulso di 150 ms e una frequenza di 50Hz. Tempo di stimolazione è impostato a 5 secondi, con una crescita dello 0,5 seconda rampa e una rampa di 0,5 secondi verso il basso. Ciò consentirà il muscolo di più gradualmente acclicompagno alla stimolazione. Nel protocollo attuale, al largo di tempo tra le contrazioni è stato impostato a 10 secondi, ma questo può essere regolata a seconda dell'effetto desiderato. Diminuzione spegnimento si tradurrà in un inizio più rapido affaticamento muscolare. Questi parametri di stimolazione sono basati su protocolli clinici progettati per migliorare la forza muscolare mediante stimolazione elettrica neuromuscolare, senza indurre danni significativi muscolo scheletrico 1, 15, 16. I topi completare due serie di 10 contrazioni, con una pausa in 5 minuti tra le serie. Per gli animali adulti, l'intensità è tipicamente NMES iniziata alle 9 mA. Dalla nostra esperienza, questo è approssimativa alla massima intensità di partenza che non induce un danno notevole passo immediatamente dopo stimolazione. Per le sessioni successive NMES, l'intensità è aumentata di 1 mA ogni volta che gli animali sono in grado di completare 20 dorsiflexions completi. A seguito del completamento della stimolazione protocollo e recomolto dall'anestesia, gli animali in genere dare prova di una normale andatura e la postura. Gait dovrebbe rimanere integro per tutta la durata del programma NMES. 4. Risultati rappresentativi Il protocollo NMES descritto in questo articolo è stato implementato in ceppi di topi, tra cui: wild type (B6/10), B6.SCID e mdx / topi SCID. Risultati rappresentativi di NMES eseguite nell'arco di 4 settimane (20 sessioni) in 3-5 mesi di età mdx / SCID sono presentati. Gli animali sono stati umanamente eutanasia mediante dislocazione cervicale mentre sotto anestesia. Il muscolo tibiale anteriore è stato raccolto ed immediatamente congelato in 2 metil-butano pre-raffreddato in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Sezioni seriali (10 um) sono stati ottenuti e montate su vetrini. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando standard di pacchetti software statistici (SPSS, v19.0 software). In primo luogo, il test di Levene è stato utilizzato per valutare se ci wal'uguaglianza delle varianze s. Campioni indipendenti t-test è stata poi effettuata per valutare le differenze tra NMES e gruppi di controllo. Ematossilina ed eosina (H & E) le macchie sono stati eseguiti per verificare se il protocollo NMES comporterebbe lesioni aumentato nel muscolo distrofico. Una sezione è stato selezionato, e le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio ottico (Nikon Eclipse E800, Nikon, Giappone). Il numero totale di fibre e il numero di fibre con nuclei in posizione centrale sono stati contati manualmente utilizzando il National Institutes of Health (NIH) – ha sviluppato software di analisi dell'immagine, immagine J. c'è stato un aumento significativo dell'indice di rigenerazione (numero di fibre centrale nucleate / numero totale di fibre) negli animali sottoposti a NMES, rispetto ai controlli (p = 0,802; figura 1). Questo suggerisce che l'applicazione di NMES non aumenta la degenerazione-rigenerazione cascata osservate in animali distrofiche, e non è quindi probabileda indurre un danno maggiore muscolare. Colorazione immunofluorescente per CD31 è stata eseguita per investigare l'effetto del 4-settimane protocollo NMES sulla vascolarizzazione muscolare. Brevemente, le sezioni muscolari sono stati fissati in formalina 4% e bloccato con il 5% siero di cavallo (HS). Le sezioni sono state incubate con un anticorpo di ratto anti-topo primario (diluizione 1:300 in 5% di HS) e trattato con 555-marcato di capra anti-topo anticorpo secondario (diluizione 1:300 in 5% di HS). Per quantificare il numero totale di cellule CD31 positive, una parte è stata selezionata, e fotografato con il microscopio a fluorescenza (Nikon Eclipse E800, Giappone). Il numero totale di capillari è stato contato manualmente utilizzando Nord Eclipse Software (Empix Imaging Inc.). C'è stato un significativo aumento del numero di cellule CD31 positive negli animali sottoposti a NMES rispetto ai controlli (p <0,01; figura 2), che indica che il protocollo NMES come descritto promuove l'angiogenesi del muscolo scheletrico. <strong> Nei test in situ contrattile: Quattro settimane dopo il completamento di un protocollo NMES, prove contrattile dei muscoli del compartimento anteriore è stata eseguita utilizzando un apparecchio di prova in situ (modello 809B, Aurora Scientific Inc, Canada), stimolatore (modello 701C, Aurora Scientific Inc , Canada), e la forza trasduttore (Aurora Scientific Inc, Canada). Brevemente, il nervo peroneo di animali anestetizzati stato isolato attraverso una piccola incisione laterale al ginocchio. I topi sono stati quindi posti in posizione supina su una piattaforma e il piede in fase di sperimentazione è stata posizionata sulla pedana. Il arti posteriori utilizzato per il test è stata stabilizzata con nastro in tessuto sul ginocchio e del piede. I muscoli sono stati stimolati utilizzando un gancio elettrodi inseriti sotto la pelle. Contrazione muscolare tetanica è stato testato con una frequenza di 150Hz per 350ms di verificare se il protocollo di 4 settimane NMES indurrebbero miglioramenti nella forza muscolare. I risultati sono stati normalizzati per il peso muscolare bagnato. C'è stato un aumento di circa il 30% in tetanic contrazione degli animali sottoposti a NMES, rispetto ai controlli (p = 0,005) (Figura 3), suggerendo il protocollo descritto migliora la resistenza dei muscoli scheletrici in mdx / SCID animali. . Figura 1 ematossilina eosina e colorazione del muscolo scheletrico distrofici (mdx) / topi immunodeficienti (4-5 mesi) (ingrandimento 10x): a) controlli non trattati, B) dopo 4 settimane di NMES. Figura 2. CD31 immunofluorescenza (rosso), come marker di vascolarizzazione muscolo scheletrico, nel muscolo scheletrico di distrofici (mdx) / topi immunodeficienti (4-5 mesi) (20x) a) controlli non trattati, B) dopo 4 settimane NMES. Figura 3. Test contrattiledei muscoli compartimento anteriore nel controllo e negli animali trattati con NMES per 4 settimane. mNm = milli Newtonmetri. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Questi risultati suggeriscono che il nostro modello sviluppato murino di NMES promuove l'angiogenesi del muscolo scheletrico (Figura 2) e il rafforzamento (Figura 3), ma non indurre un danno del muscolo scheletrico (Figura 1).

Va osservato che i parametri di stimolazione descritti qui sono stati progettati per indurre un muscolo sovraccarico ai muscoli compartimento anteriore. Così come è il caso per scenari clinici, il posizionamento degli elettrodi può essere regolato per stimolare altri gruppi muscolari, sebbene la risposta di muscolo NMES può essere diverso, a seconda del tipo di composizione delle fibre. NMES durata, il numero totale di sessioni di trattamento, e il numero totale di ripetizioni può essere modificato secondo lo studio di progettazione.

Come con qualsiasi protocollo, questo metodo ha dei limiti che devono essere notato. Nel presente studio, la stimolazione è stata eseguita sopra il nervo peroneale profondo. Tuttavia, nella clinica, la stimolazione is in genere somministrato al gruppo motore. Nel modello animale, la stimolazione del nervo richiederebbe una intensità inferiore in modo da ottenere la contrazione muscolare piena. Un altro limite del modello presentato è che siamo in grado di ottenere informazioni riguardanti il ​​livello di comfort durante l'applicazione del NMES, dato che gli animali sono anestetizzati. Pertanto, la tollerabilità di intensità paragonabile in una popolazione clinica è difficile da valutare. Tuttavia, i nostri risultati istologici suggeriscono il nostro modello NMES, come descritto, non induce lesioni muscolari.

Lo sviluppo di modelli animali che imitano le modalità comunemente implementate in clinica ci forniscono utili strumenti di laboratorio che consente una migliore comprensione delle risposte cellulari e molecolari per interventi terapeutici. Inoltre, tali modelli sono utili per condurre studi pre-clinici per affinare entrambi i protocolli di riabilitazione esistenti e sviluppare nuove indicazioni.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Vector wire wrap posts with bifurcated solder terminal	Newark	T68
Vector circuit board	Newark	3662-2
Pomona patch cord	Newark	P-36-0
5 minute epoxy	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 Electrode Gel	Milliken Medical	MR41217
Portable neuromuscular stimulation device	EMPI	300pv