Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione
Summary
Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.
Abstract
Lipopolisaccaride (LPS) è un componente principale delle membrane batteriche Gram-negativi esterni. Si tratta di una molecola composta dal lipide A, che è incorporato nella membrana esterna, un oligosaccaride e ripetibile nucleo O-antigene unità che si estendono verso l'esterno dalla superficie della cella 1, 2. LPS è una molecola immunodominante che è importante per la virulenza e patogenesi di molte specie batteriche, tra Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Escherichia coli e 3-5, e le differenze di LPS O-antigene composizione forma la base per la sierotipizzazione di ceppi. LPS è coinvolto in attaccamento alle cellule ospiti all'inizio della infezione e fornisce protezione da complemento-mediata uccisione; ceppi privi LPS può essere attenuato per virulenza 6-8. Per queste ragioni, è importante visualizzare LPS, in particolare da isolati clinici. LPS visualizzando bande modelli e il riconoscimento da uno specificontibodies possono essere strumenti utili per identificare i lignaggi di deformazione e caratterizzare i vari mutanti.
In questa relazione, si descrive un hot-fenolo acquoso metodo per l'isolamento e la purificazione di LPS da cellule batteriche gram-negativi. Questo protocollo consente l'estrazione di LPS lontano da acidi nucleici e proteine che possono interferire con visualizzazione di LPS che si verifica con brevi e metodi di estrazione meno intensi 9. LPS preparato in questo modo possono essere separati da sodio dodecil solfato (SDS)-poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e direttamente colorati usando carboidrati / glicoproteina macchie o normali metodi di colorazione d'argento. Molti anti-sieri di LPS contenere anticorpi che cross-reagiscono con le proteine della membrana esterna o altri bersagli antigenici che possono ostacolare la reattività osservati dopo immunoblot occidentale SDS-PAGE separate da lisati cellulari grezzi. Proteasi trattamento di lisati cellulari grezzi da sola non è sempre un modo efficace per rimuovere questosfondo di utilizzare questo o altri metodi di visualizzazione. Inoltre, il trattamento della proteasi esteso nel tentativo di eliminare questo sfondo può portare a LPS scarsa qualità che non è ben risolto da uno qualsiasi dei metodi summenzionati. Per queste ragioni, riteniamo che il seguente protocollo, adattato da Westpahl Jann e 10, è l'ideale per l'estrazione LPS.
Protocol
Discussion
Abbiamo descritto un metodo di purificazione LPS lontano dagli altri componenti cellulari, tra cui gli acidi nucleici e proteine. Questo metodo consente di alta qualità LPS che possono essere utilizzati in un certo numero di metodi di visualizzazione differenti, compresa la colorazione carboidrati di SDS-PAGE gel, come mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per sierotipo LPS da una varietà di ceppi, utilizzando specifici anti-sieri, o per mostrare connessione tra isolati tramite visualizzazione …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health e dalla Fondazione Fibrosi Cistica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
Referências
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