Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen
Summary
Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 × 10<sup> 8</sup> Cellen per preparaat met levensvatbaarheid van de cellen tussen de 88 ~ 96%.
Abstract
Primaire hepatocyten cultuur is een waardevol instrument, dat uitvoerig is gebruikt voor fundamenteel onderzoek van de leverfunctie, ziekte, pathofysiologie, farmacologie en andere gerelateerde onderwerpen. De methode op basis van twee-staps collagenase perfusie voor isolatie van intacte hepatocyten werd voor het eerst geïntroduceerd door Berry en vriend in 1969 1 en sindsdien is er veel aan wijzigingen. De meest gebruikte techniek is beschreven door Seglenin 1976 2. In wezen, hepatocyten zijn gescheiden van volwassen ratten verdoofd door een niet-recirculerende collagenase perfusie via de poortader. De geïsoleerde cellen worden vervolgens gefiltreerd door een 100 pm gaas poriegrootte nylonfilter en gekweekt op platen. Na 4 uur cultuur, wordt het medium vervangen met serum-bevattende of serum-vrij medium, bijvoorbeeld HepatoZYME-SFM, voor extra tijd om cultuur. Deze procedures vereisen chirurgische en steriele cultuur stappen die beter kunnen worden door video aangetoond dan door tekst. Here, we documenteren de gedetailleerde stappen voor deze procedures video en schriftelijk protocol, die steeds mogelijk de productie van levensvatbare hepatocyten in grote aantallen.
Protocol
Discussion
Primaire cultuur van hepatocyten is een in vitro model algemeen gebruikt om de verschillende aspecten van lever fysiologie en pathologie te bestuderen. Zo wordt de primaire cultuur gebruikt om de expressie en functie van geneesmiddel-metaboliserende enzymen waaronder cytochroom P450, metabolisme van geneesmiddelen, geneesmiddel-geneesmiddel interacties, en de mechanismen van cytotoxiciteit en genotoxiciteit 3-7 te beoordelen. Het protocol beschrijft het kweken van ratten levercellen is een bewerking …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag aan de heer Josh Basford en Dr Xiao-min Li bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies (DK70992 en DK92779 tot ML).
Referências
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
