Imagerie par bioluminescence de l'activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

Summary

NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Abstract

NADPH oxydase est une enzyme essentielle qui assure la médiation défense de l'hôte antibactérienne et antifongique. En plus de son rôle dans la défense de l'hôte antimicrobienne, la NADPH oxydase a les fonctions essentielles de signalisation qui modulent la réponse inflammatoire ^1. Ainsi, le développement d'une méthode de mesure en "temps réel" la cinétique de la NADPH oxydase dérivée de génération de ROS est prévu pour être un outil de recherche précieux pour comprendre les mécanismes pertinents de défense de l'hôte, de l'inflammation et des blessures.

Granulomatose chronique (CGD) est une maladie héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections graves et de l'inflammation excessive. L'activation de la NADPH oxydase phagocytaire nécessite la translocation de ses sous-unités cytosoliques (p47 ^phox, p67 ^phox, p40 ^phox et) et Rac à un flavocytochrome liée à la membrane (composé d'un ^phox gp91 et p22 ^phox hétérodimère). Pertedes mutations de fonction dans l'un de ces composants résultat oxydase NADPH en DMC. Similaires aux patients atteints de CGD, gp91 ^phox souris déficientes en p47 ^phox et les souris déficientes ont une activité défectueuse NADPH oxydase phagocytaire et l'hôte altération de la défense ^{13, 14.} En plus des phagocytes, qui contiennent les composants de la NADPH oxydase décrites ci-dessus, une variété de types de cellules expriment différentes isoformes de la NADPH oxydase.

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier la production de ROS chez les souris vivantes et de délimiter la contribution de la NADPH oxydase à la génération de ROS dans les modèles d'inflammation et des blessures. Cette méthode est basée sur la réaction de ROS L-012 (un analogue de luminol) pour émettre de la luminescence qui est enregistrée par un dispositif à couplage de charge (CCD). Dans la description originale de la sonde L-012, L-012-dépendante chimioluminescence a été complètement abolie par la superoxyde dismutase, ce qui indique que la principale ROS détecté dans cette réaction était superanion oxyde ^15. Des études ultérieures ont montré que la L-012 peut détecter les autres radicaux libres, y compris les espèces réactives de l'azote ^{16, 17.} Kielland et al. ¹⁷ ont montré que l'application topique d'acétate de phorbol myristate, un puissant activateur de la NADPH oxydase, mené en NADPH oxydase dépendante de la production de ROS qui pourrait être détectée chez les souris en utilisant la sonde luminescente L-012. Dans ce modèle, ils ont montré que la luminescence L-012-dépendante a été aboli en p47 ^phox souris déficientes.

Nous avons comparé la génération de ROS dans les souris de type sauvage et NADPH oxydase déficiente en p47 ^{phox-/ – ont 2} dans les trois modèles suivants: 1) l'administration intratrachéale de zymosan, une cellule pro-inflammatoire fongique mur produit dérivé qui permet d'activer la NADPH oxydase; 2) ligature caecale et ponction (CLP), un modèle de sepsis intra-abdominal avec une inflammation pulmonaire aiguë secondaire et des blessures, et 3) le tétrachlorure de carbone par voie orale(CCl _4), un modèle de lésion hépatique ROS-dépendante. Ces modèles ont été spécifiquement choisis pour évaluer la NADPH oxydase dépendante de la production de ROS dans le cadre de l'inflammation non infectieuse, la septicémie polymicrobienne, et la toxine induite par une lésion d'organe, respectivement. En comparant la bioluminescence chez la souris de type sauvage de p47 ^{phox-/ – ont} nous permet de définir la contribution spécifique de ROS générés par p47 ^phox de la NADPH oxydase contenant au signal bioluminescent dans ces modèles.

Résultats de l'imagerie de bioluminescence qui ont démontré une augmentation des niveaux de ROS dans les souris de type sauvage par rapport à p47 ^{phox-/ – ont} indiqué que la NADPH oxydase est la principale source de production de ROS en réponse à des stimuli inflammatoires. Cette méthode offre une approche minimalement invasive pour "temps réel" suivi de la production de ROS au cours de l'inflammation in vivo.

Protocol

1. Modèles animaux Souris: Utilisez p47 phox-/ – souris et d'âge et le sexe assortie souris C57BL6/DBA. Obtenir l'approbation pour des expériences de protection des animaux et du Comité institutionnel utilisation. Anesthésie: Utiliser un système d'administration continue isoflurane pour induire une anesthésie. Le système de vaporisation (VetEquip) est rempli avec de l'isoflurane (2-3%). Assurez-vous que les souris sont pleinement anesthésiés par l'ob…

Discussion

"En temps réel" la mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS) chez les animaux vivants peuvent être obtenus en utilisant des sondes fluorescentes et chimiluminescence. Tandis que les sondes fluorescentes comportant souffrent de faiblesse de signal sur bruit ^12, la technique d'imagerie décrit est plus sensible à la détection de l'émission de lumière à la suite d'une réaction chimique de ROS avec le substrat à base de luminol L-012. Comme toutes les techniques d'i…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116