Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

Summary

NADPH ossidasi è la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in fagociti. A causa della natura effimera dei ROS, è difficile misurare e monitorare i livelli di ROS negli animali viventi. Un metodo minimamente invasivo per la quantificazione seriale di ROS in topi viventi è descritto.

Abstract

NADPH ossidasi è un enzima critico che media difesa dell'ospite antibatterica e antimicotica. Oltre al suo ruolo nella difesa dell'ospite antimicrobica, NADPH ossidasi ha funzioni critiche di segnalazione che modulano la risposta infiammatoria ^1. Pertanto, lo sviluppo di un metodo per misurare in "tempo reale" la cinetica di NADPH ossidasi derivata generazione di ROS dovrebbe essere un valido strumento di ricerca per comprendere i meccanismi pertinenti per ospitare difesa, infiammazione e lesioni.

Malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia ereditaria del NADPH ossidasi caratterizzato da gravi infezioni e infiammazioni eccessivo. L'attivazione della NADPH ossidasi dei fagociti richiede traslocazione delle sue subunità citosoliche (p47 ^phox, p67 ^phox e p40 ^phox) e Rac ad una membrana legato flavocytochrome (composto da un ^phox gp91 e p22 ^phox eterodimero). Perditadi funzione mutazioni in uno qualsiasi di questi risultati NADPH ossidasi componenti in CGD. Come per i pazienti con CGD, gp91 ^phox-carente topo e p47 ^phox-carenza topi hanno difettoso fagocita attività della NADPH ossidasi e di accoglienza alterata difesa ^{13, 14.} Oltre a fagociti, che contengono i componenti sopra descritti NADPH ossidasi, una varietà di altri tipi di cellule esprimono diverse isoforme di ossidasi NADPH.

Qui, descriviamo un metodo per quantificare la produzione di ROS nei topi di vita e di delineare il contributo della NADPH ossidasi di generazione di ROS in modelli di infiammazione e lesioni. Questo metodo si basa su ROS reagire con L-012 (un analogo del luminol) per emettere luminescenza che è registrato da un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD). Nella descrizione originale della L-012 probe, L-012-dipendente chemiluminescenza è stata completamente abolita dal superossido dismutasi, indicando che il principale ROS rilevato in questa reazione era superossido di anione ^15. Studi successivi hanno dimostrato che la L-012 in grado di rilevare altri radicali liberi, comprese le specie reattive dell'azoto ^{16, 17.} Kielland et al. ¹⁷ hanno dimostrato che l'applicazione topica del forbolo miristato acetato, un potente attivatore di NADPH ossidasi, portato in NADPH ossidasi-dipendente generazione di ROS che potrebbe essere rilevata nel topo, utilizzando la sonda luminescente L-012. In questo modello, hanno mostrato che la luminescenza L-012-dipendente è stata abolita nel p47 ^phox-carente topo.

Abbiamo confrontato generazione di ROS nei topi di tipo selvatico e NADPH ossidasi-carente p47 ^{phox-/ –} mice ² nei seguenti tre modelli: 1) somministrazione intratracheale di zymosan, un pro-infiammatoria della parete cellulare fungina prodotto derivato che può attivare NADPH ossidasi; 2) legatura del cieco e la puntura (CLP), un modello di sepsi intra-addominale secondaria infiammazione polmonare acuta e del pregiudizio, e 3) tetracloruro di carbonio per via orale(CCl _4), un modello di ROS-dipendente danno epatico. Questi modelli sono stati specificamente selezionati per valutare ossidasi NADPH-dipendente generazione di ROS nel contesto di infiammazione non infettiva, sepsi polimicrobica e tossina danno indotto organo, rispettivamente. Confrontando bioluminescenza nei topi di tipo selvatico di p47 ^{phox-/ –} mice ci permette di delineare il contributo specifico di ROS generato da p47 ^phox contenente NADPH ossidasi al segnale bioluminescente in questi modelli.

Risultati di imaging bioluminescenza che hanno dimostrato un aumento dei livelli di ROS nei topi di tipo selvatico rispetto al p47 ^{phox-/ –} topi ha indicato che NADPH ossidasi è la principale fonte di generazione di ROS in risposta a stimoli infiammatori. Questo metodo fornisce un approccio minimamente invasivo per il monitoraggio "in tempo reale" di generazione di ROS durante l'infiammazione in vivo.

Protocol

1. Modelli animali Mouse: utilizzare p47 phox-/ – topi e per età e sesso-abbinato topi C57BL6/DBA. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti di cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Anestesia: Utilizzare un sistema continuo di amministrazione isoflurano per indurre l'anestesia. Il sistema vaporizzatore (VetEquip) è riempito con isoflurano (2-3%). Verificare che i topi sono completamente anestetizzati osservando la respirazione, il movimento, e riflesso …

Discussion

Misurazione "tempo reale" di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in animali viventi può essere ottenuto utilizzando sonde fluorescenti e chemiluminescenza. Mentre sonde fluorescenti soffrono avente deboli segnale-rumore ¹² rapporti, la tecnica di imaging descritta è più sensibile per la rilevazione di emissione di luce dopo una reazione chimica di ROS con il luminol substrato a base di L-012. Come tutte le tecniche di imaging bioluminescenti, questa metodologia è limitata dalla lunghezza d&#…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116