En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel
Summary
I denne artikkelen, er en enkel, kvantitativ, væskefase affinitet fangst analysen presentert. Det er en pålitelig teknikk basert på samspillet mellom magnetiske kuler og merkede proteiner (f.eks nanobodies) på den ene siden og affinitet mellom tagget protein og en andre, merket protein (f.eks poliovirus) på den andre.
Abstract
I denne artikkelen, er en enkel, kvantitativ, væskefase affinitet fangst analysen presentert. Forutsatt at ett protein kan merkes og annet protein merket, kan denne metoden skal gjennomføres for undersøkelse av protein-protein interaksjoner. Den er basert på en hånd på anerkjennelse av den tagget protein ved kobolt belagt magnetiske perler og på den andre hånden på samspillet mellom tagget protein og en andre bestemt protein som er merket. Først blir merket og kodet proteiner blandet og inkubert ved romtemperatur. De magnetiske perler, som gjenkjenner koden, er lagt til og det bundne fraksjonen av merket protein er atskilt fra den ubundne fraksjonen bruke magneter. Mengden av merket protein som fanges kan bestemmes på en indirekte måte ved å måle signalet til merket protein forble i den ubundne fraksjonen. Den beskrives væskefase affinitet analysen er svært nyttig når konformasjonsforandringer konvertering sensitive proteiner er assayed. Utvikling og anvendelse av analysen er vist for samspillet mellom poliovirus og poliovirus gjenkjenne nanobodies 1. Siden poliovirus er følsom for konformasjonsforandringer konvertering 2 når festet til en fast overflate (upubliserte resultater), er bruken av ELISA begrenset og en flytende fase system bør derfor foretrekkes. Et eksempel på en flytende fase system ofte brukt i polioresearch 3,4 er mikro protein A-immunoprecipitation test 5. Selv om denne testen har vist sin anvendbarhet, krever det en Fc-struktur, som er fraværende i de nanobodies 6,7. Men som en annen mulighet, kan disse interessante og stabil single-domene antistoffer 8 enkelt konstruert med ulike koder. Den brukte (Hans) 6-tag viser affinitet for Bivalente ioner som nikkel eller kobolt, som kan på sin side lett belegg på magnetiske kuler. Vi har derfor utviklet denne enkle kvantitativeaffinitet fangst analysen basert på kobolt belagt magnetiske kuler. Poliovirus var merket med 35 S for å aktivere uhindret samspill med nanobodies og gjøre en kvantitativ deteksjon mulig. Metoden er enkel å utføre og kan etableres med en lav kostnad, som er videre støttet av muligheten til å effektivt gjenoppfriske de magnetiske perler.
Protocol
Discussion
I protokollen er radioaktiviteten av antigen samhandle med nanobody definert som tap av radiomerket virus fra supernatanten. Derfor mengden av utfelt radioaktivitet (= 100 – en%) (bundet til de magnetiske kuler) kan estimeres på en indirekte måte ved radioaktivitet i supernatanten (= en%). På den annen side er det også mulig å måle radioaktivitet av utfelt bundet brøkdel av antigen på en direkte måte ved eluting de immunocomplexes fra magnetiske kuler med 500 mm imidazole. Det ble tidligere vist 11 a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker de ansatte på avdeling for Pharmaceutical bioteknologi og molekylærbiologi og spesielt Monique De Pelsmacker for utarbeidelse av radioaktivt merket viruset. Vi er takknemlige til Ellen Merckx og Hadewych Halewyck for sine interessante bemerkninger og diskusjoner og til Gerrit De Bleeser for hans hjelp i laboratoriet. Dette arbeidet ble finansielt støttet av en OZR tilskudd av Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), den Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) og Verdens helseorganisasjon (TSA 200 410 791). Lise Schotte er en predoctoral Fellow ved Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Referências
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
