Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco adiposas 1.
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Artigo de método
Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC
Neste artigo
Resumo
Resumo
Polímeros naturais ao longo dos anos ganharam mais importância devido à sua biocompatibilidade hospedeiro e capacidade de interagir com células in vitro e in vivo. Uma área de investigação que tem a promessa em medicina regenerativa é o uso combinatória de novos biomateriais e células estaminais. Uma estratégia fundamental no campo da engenharia de tecidos é o uso de tridimensional andaime (por exemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogéis, micro / nano partículas) para dirigir a função da célula. Esta tecnologia tem evoluído a partir da descoberta de que as células precisam de um substrato sobre o qual podem aderir, proliferar, e expressar seu fenótipo diferenciado celular e função 2-3. Mais recentemente, tem sido também determinado que as células não só a utilização destes substratos para a adesão, mas também interagir e tomar pistas a partir do substrato da matriz (matriz, por exemplo, extracelular, ECM) 4. Portanto, as células e andaimes ter uma ligação recíproca queserve para controlar o desenvolvimento do tecido, organização e função final. As células-tronco adiposas (ASC) são mesenquimais, as células estaminais hematopoiéticas não-apresentar no tecido adiposo que podem exibir multi-linhagem diferenciação e servir como uma fonte prontamente disponível de células (isto é pré-vascular endotélio e pericitos). Nossa hipótese é que as células-tronco derivadas de tecido adiposo pode ser direcionado para diferentes fenótipos simultaneamente, bastando co-cultura-los em matrizes bifásicos 1. O nosso laboratório é focado sobre a cicatrização de feridas dérmica. Para este fim, foi criada uma única matriz composta a partir de os biomateriais naturais, fibrina, colagénio, quitosano e que pode imitar as características e funções de um ambiente de cicatrização da ferida dérmica específico ECM.
Protocolo
1. Isolamento de células-tronco adiposas (ASC) 1, 5
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como 5 descrito anteriormente. Este estudo foi conduzido em conformidade com o Animal Welfare Act, os regulamentos de execução do bem-estar animal e de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
- Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS ....
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Discussão
ASC são bem conhecidos pela sua facilidade de isolamento e capacidade de diferenciar para vários tipos de células. Com as técnicas descritas neste manuscrito, somos capazes de explorar a plasticidade da ASC por expor essas células para biomatrices múltiplos simultaneamente. Como as células migram para longe de sua base CSM e entrar no seu meio ambiente extracelular, as células tomar sugestão do andaime e pode manter "stemness" (colágeno) ou ser induzido a diferenciar os tipos de células para vasculares e vascu.......
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Divulgações
Não há interesses conflitantes financeiros existem.
Alerta
As opiniões ou afirmações contidas neste documento são as opiniões pessoais dos autores e não devem ser interpretadas como oficial ou refletindo as opiniões do Departamento de Defesa ou o Governo dos EUA. Os autores são funcionários do governo dos EUA, e este trabalho foi elaborado como parte das suas funções oficiais. Todo o trabalho foi apoiado pelo EUA Pesquisa Médica do Exército e do Comando de Material. Este estudo foi realizado ao abrigo de um protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Ética Médica EUA Exército e do Comando de Material Conselho de Revisão Institucional e de acordo com o protocolo aprovado.
Agradecimentos
SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh. DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / equipamentos | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumível |
| Soro Fetal Bovino | Hyclone | SH30071.03 | Consumível |
| Colagenase do Tipo II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumível |
| 70-iM filtro de rede de nylon | BD Biosciences | 352350 | Consumível |
| 100-iM filtro de rede de nylon | BD Biosciences | 352360 | Consumível |
| MesenPRO Sistema Meio de Crescimento | Invitrogen | 12746-012 | Consumível |
| L-Glutamina | Gibco | 25030 | Consumível |
| CaCl 2 .2 H 2 O | Sigma | C8106 | Consumível |
| T75 frasco de cultura de tecidos | BD Biosciences | 137787 | Consumível |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumível |
| Ácido Acético | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumível |
| N-octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumível |
| Sorbitano-mono-oleato | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumível |
| Hidróxido de Potássio | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumível |
| Acetona | Fisher Scientific | L-4859 | Consumível |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumível |
| Trinitro benzenossulfónico | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumível |
| Ácido clorídrico | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumível |
| Éter etílico | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumível |
| 8 m de tecido Placa Insere Cultura | BD Biosciences | 353097 | Consumível |
| 1,5 ml tubos de microcentrífuga | Pescador | 05-408-129 | Consumível |
| Reagente MTT | Invitrogen | M6494 | Consumível |
| Sulfóxido de dimetilo | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumível |
| Qtracker celular Labeling Kit (QRastreador 655) | Sondas moleculares | Q2502PMP | Consumível |
| Colágeno tipo 1 | Travigen | 3447-020-01 | Consumível |
| Hidróxido de Sódio | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumível |
| 12-Bem Cultura Pratos Tecido | BD Biosciences | 353043 | Consumível |
| Fibrinogênio | Sigma | F3879 | Consumível |
| Trombina | Sigma | T6884 | Consumível |
| Derivada Benztriazole de Polietileno | Sunbio | DE-034GS | Consumível |
| Tampão de Tris Tablet (pH 7,6) | Sigma | T5030 | Consumível |
| Centrifugar | Eppendorf | 5417R | Equivolvimento |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipamento |
| Incubadora de CO umidificado com Air-5 2% | Thermo Scientific | Modelo 370 | Equipamento |
| Agitador | IKA | Visc6000 | Equipamento |
| Agitador Magnético | Corning | PC-210 | Equipamento |
| Exsicador de vácuo | - | - | Equipamento |
| Analisador de Tamanho de Partícula | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipamento |
| Banho de água | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipamento |
| Espectrofotômetro | Beckman | Beckman Coulter DU Espectrofotômetro 800UV/Visible | Equipamento |
| Vórtice | Diagger | 3030a | Equipamento |
| Leitora | Molecular Devices | Spectramax M2 | Equipamento |
| Luz / microscópio de fluorescência | Olimpo | IX71 | Equipamento |
| Microscópio confocal | Olimpo | FV-500 Laser Scanning microscópio confocal | Equipamento |
| Microscópio Eletrônico de Varredura | Carl Zeiss microfilmagem | Leo 435 VP | Equipamento |
| Microscópio eletrônico de transmissão | JEOL | JEOL 1230 | Equipamento |
Referências
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S.
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Reimpressões e permissões
