Vi beskriver en rask metode for å isolere og kultur hippocampus og kortikale nevroner fra gnagere embryoer. Denne protokollen tillater oss å utføre eksperimenter der nesten rene nevrale kulturer er nødvendig.
Vi beskriver en rask metode for å skille og kultur hippocampus eller kortikale nevroner fra E15-17 rotte embryoer. Prosedyren kan brukes med hell til isolering av mus og menneskelige primære nerveceller og nevrale stamceller. Dissosiert nevroner er opprettholdt i serum-fri medium opptil flere uker. Disse kulturene kan brukes til nucleofection, immunocytochemistry, nukleinsyrer forberedelse, samt elektrofysiologi. Eldre nevrale kulturer kan også bli tilført med en god virkningsgrad ved lentiviral transduksjon og mindre effektivt, med kalsiumfosfat eller lipid-baserte metoder som lipofectamine.
Metoden for disseksjon og kultur av rotter hippocampus og kortikale nevroner beskrevet her kan utføre eksperimenter med nesten rene nevrale kulturer dyrket i en kjemisk definert medium (figur 3). Selv protokoller for dyrking nesten rene nevroner i serum-frie medier har tidligere blitt beskrevet 2,3,4, det er viktige endringer i vår metode. Forskjellig fra tradisjonelle protokoller (dvs. Banker et al.) 5, vi har erstattet trypsin med TrypLE Express, en mer skånsom dissosiasjon en…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jonna Ellis for redaksjonell hjelp. Prosjektet beskrives ble støttet av Award Antall R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn av National Institute of Mental Health eller National Institutes of Health.
Reagent | Concentration |
Neurobasal | 98% |
B27 | 2% |
Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
Reagent | Concentration |
Glucose | 16 mM |
Sucrose | 22 mM |
HEPES | 10 mM |
NaCl | 160 mM |
KCl | 5 mM |
Na2HPO4 | 1 mM |
KH2PO2 | 0.22 mM |
Gentamicin | 50 μg/ml |
Fungizone | 250 ng/ml |
pH | 7.4 |
Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
Reagent | Volume (μl) |
Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
Reagent | Company | Cat. number |
Hibernate E | Brainbits | 767171 |
Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
Equipment | Company | Cat. number |
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
Large Forceps | FST | 11022-14 |
Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
100 mm dishes | Corning | 430167 |
15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.