Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação In vivo Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.
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Artigo de método
Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. 1 reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. 2, 3 activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. 4 <p = classe "jove_content"> Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas 5 com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). 6, 7
Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 8.
Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, 9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. 8
Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato 13 como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método.
Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.
Protocolo
1. Anestesia e Monitorização
- Apropriadas ética nacionais e institucionais devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Após a aprovação do Comitê de Ética anestesiam ratos machos Sprague Dawley com peso de 120-180 g. Entregar 2 - 3% vol isoflurano a uma caixa de acrílico através de vaporizador de isoflurano e coloque dentro de rato.
- Logo que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de reacção ao dedo do pé ou pitada cauda) no rato é pesado e raspada na área ventral cervical.
- Colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C e aplicar isoflurano em ....
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Discussão
Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. 26 microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo 27, 28, é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avaliar melhor a relevância
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado por uma concessão do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" para SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do equipamento: | Empresa: | N º de Catálogo: | Comentários: |
| Forene 100% (V / V) | Abade | B506 | API isoflurano |
| Terylene Sutura | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex fina Diâmetro Tubos de polietileno | Smiths Medical | 800/100/100 | 0,28 mm de diâmetro interno |
| 0,9% de solução salina | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Mudanças-A ponta de luxo kit cauterização | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath-T 14G | Venisystems | G713- A01 | utilizado como tubo de lente |
| Ventilador Servo 900C | Maquet | utilizado como ventialtor animais | |
| Transdutor de pressão lógico | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 monitor | Siemens | ||
| ABL 700 bancada Analyzer | Radiômetro | para medição de gás de sangue | |
| Almofada de aquecimento | Effenberger | 8319 | |
| Estágio de alumínio | Alfun | AW7022 | |
| Microscópio cirúrgico OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microcirúrgica instrumentos de laboratório set | S & T | 767 | |
| Biemer clipe de navio | Diener | 64,562 | |
| Aplicando fórceps | Diener | 64,568 | para Biemer clipe de navio |
| Rodamina 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline branco DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cubra óculos | 32x32 milímetros | ||
| Configuração intravital | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | microscópio de epifluorescência |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fonte de luz de fluorescência |
| Colibri Sistema 2 | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plano Apochromat-20x / 1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | objetiva de imersão de água |
| AxioCam MRM Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | de alta resolução da câmera digital |
| Axio LE visão software | Carl Zeis | 410130 | utilizar para análise offline |
Referências
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N.
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Reimpressões e permissões
