ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI）
Summary
精巣挙筋微小循環における毛細血管細静脈のデジタル生体蛍光顕微鏡では、白血球 – 内皮相互作用への洞察を得るために便利な方法です。<emin vivoでの></em>横紋筋組織の虚血再灌流障害（IRI）であった。ここでは、安全技術を実行し、その応用と限界を議論するための詳細なプロトコルを提供しています。
Abstract
虚血再灌流障害（IRI）は、このような脳卒中、心筋梗塞、腸管虚血などの移植や心臓血管手術後などの病的状態の大きな配列に関与しています。以前は虚血組織の1再灌流、不可逆的な予防のために不可欠ながら、組織損傷は、罹患組織の過度の炎症を誘発する。活性酸素種の産生、補体系の活性化と増加した血管透過性に隣接し、白血球の活性化は、再灌流時の炎症性組織損傷の病理学的カスケードの原則俳優の一人です。2、3、白血球の活性化は成る多段階のプロセスです。ローリング、強固な接着と輪廻のような補因子、ケモカイン、または血小板活性化因子としての化学誘引物質に応答して、接着分子との間の複雑な相互作用によって媒介される。4
<Pクラスは= "jove_content">毛細血管細静脈における白血球のローリングは、主に彼らのカウンターリガンドとセレクチン5の相互作用によって媒介されていますが、内皮への白血球の強固な接着は細胞間接着分子（ICAM）、血管の細胞への結合を介してセレクチン制御です。接着分子（VCAM）。6、7白血球-内皮相互作用の in vivo観察のためのゴールドスタンダードは、1968年に記載され生体内顕微鏡の技術である8。
IRI（虚血再灌流障害）の様々なモデルが様々な器官のために記載されているものの、9月12日わずか数は、画像品質の高いレベルでの微小血管床における白血球動員の直接可視化に適しています。8
ここでは精巣挙筋微小循環の後毛細血管細静脈のデジタル生体蛍光顕微鏡を促進するラット13の定性的かつ定量的に横紋筋組織中のIRI-研究のための白血球動員を分析し、技術を達成するための詳細なマニュアルを提供する便利な方法として。我々はさらに一般的な落とし穴を説明し、読者が本当に感謝することができ、かつ安全にする方法を実行する必要があり有用なヒントを提供しています。
ステップのプロトコル·バイ·ステップでは、より長い期間の動物はしっかりと麻酔を維持するのに十分な監視の下で呼吸制御された麻酔の使用を開始する方法を表しています。その後、卓越した光学分割のための薄い平らなシートとして挙準備を説明し、よく私たちの研究室で確立されているIRIで白血球イメージングのためのプロトコルを提供しています。
Protocol
1。麻酔および監視動物実験を行う前に、適切な国や機関の倫理が場所でなければなりません。 180グラム – 120から体重の倫理委員会麻酔雄Sprague Dawleyラットからの承認に続く。イソフルラン気化器を介してプレキシグラスボックスに3体積％イソフルランおよびラットの内側に置く – 2を提供します。 麻酔の適切なレベルが達成されるとすぐに（つま先またはテールピンチへの?…
Discussion
白血球-内皮相互作用、活性酸素種の産生および補体系の活性化IRI-誘発組織障害の主要な特徴である26は、罹患組織の微小循環は、炎症の発症の積分サイトと見なされます。別にそのようなフローチャンバーアッセイとしてex vivoでの実験を27日、28日からは、さらにin vivoでの関連で評価するために生体内イメージングの定評のあるモデルを提供するために?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、SU Eisenhardtに "ドイツ学術振興"（EI 866/1-1）の助成金によって支えられている。
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
Referências
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Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle. J. Vis. Exp. (66), e3973, doi:10.3791/3973 (2012).