쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)
Summary
cremasteric microcirculation의 postcapillary venules 디지털 intravital epifluorescence 현미경은 백혈구 – 내피 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수있는 편리한 방법입니다<em> 생체내에서</em> 평형으로 뻗은 줄이있는 근육 조직의 국소 빈혈 reperfusion – 상해 (IRI) 인치 우리는 여기서 안전하게 기술을 수행하고 응용 프로그램과 한계를 논의하기 위해 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
돌이킬 방지에 필수적인 반면 국소 빈혈 – reperfusion 상해 (IRI)는 같은 대뇌 뇌졸중, 심근 경색, 장내 국소 빈혈뿐만 아니라 이전에 허혈성 조직 이식과 심장 혈관 수술 1. Reperfusion 다음과 같은 병적인 조건의 큰 배열에 연루되어 조직 부상이 영향을받는 조직의 과도한 염증을 elicits. 반응성 산소 종, 보완 시스템의 활성화의 생산 및 microvascular 투자율 증가 인접, leukocytes의 활성화가 reperfusion 동안 염증성 조직 손상의 병적인 폭포의 주요 배우 중 하나이다. 2, 3 백혈구 활성화 구성된 다단계 프로세스입니다 , 압연 확고한 접착력과 윤회와 같은 보완 요인, chemokines, 또는 혈소판 – 활성 요소로 chemoattractants에 대한 응답으로 유착 분자 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 매개된다. 4
<P 클래스 = "jove_content"> postcapillary venules에서 백혈구 구름은 주로 자신의 카운터 리간드, 내피로 leukocytes의 확고한 유착 세포 접착 분자 (ICAM)과 혈관 세포에 바인딩을 통해 selectin 조절과 함께 selectins 5의 상호 작용에 의해 매개되는 동안 유착 분자 (VCAM). 6, 7백혈구 – 내피 상호 작용의 생체내 관찰에 대한 골드 표준 먼저 1968 년 설명한 intravital 현미경의 기법이다 8.
IRI (국소 빈혈 reperfusion-상해)의 다양한 모델이 여러 장기에 대한 설명되어 있지만, 9-12 오직 소수 이미지 품질을 높은 수준에서 microvascular 침대에 백혈구 모집의 직접적인 시각화에 적합 8.
우리는 여기서 cremasteric microcirculation에 postcapillary venule의 디지털 intravital epifluorescence 현미경을 촉진질적 및 양적 줄무늬가 근육 조직에서 IRI – 연구 백혈구 모집을 분석하고 기술을 달성을위한 상세한 매뉴얼을 제공하는 편리한 방법으로 쥐 13. 우리는 더 이상 일반적인 함정을 설명하며 독자가 진정으로 감사 있도록하고, 안전하게 방법을 수행해야합니다 유용한 팁을 제공합니다.
단계 프로토콜에 의해 단계에서 우리는 시간의 긴 기간 동안 동물이 단단히 anesthetized 유지하는 데 충분한 감시하에 호흡 조절 마취를 시작하는 방법을 묘사. 그러면 뛰어난 광학 해상도 얇은 평면 시트로 cremasteric 준비를 설명하고 잘 우리의 실험실에 설립되었습니다 IRI에서 백혈구 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
1. 마취 및 모니터링 동물 실험을 수행하기 전에 해당 국가 및 기관의 윤리는 제자리에 있어야합니다. 180g – 120에서 체중과 윤리위원회 마취 수컷 Sprague Dawley 쥐처럼의 승인을 따라. isoflurane 기화기를 통해 플렉시 글라스 상자에 3 시리즈의 % isoflurane과 쥐의 내부 배치 – 2을 제공합니다. 마자 마취의 적절한 수준이 달성되면 (발가락이나 꼬리 공략하기 위해 반응의 부족) 쥐가 가중치?…
Discussion
백혈구 – 내피 상호 작용, 반응성 산소 종의 생산과 보완 시스템의 활성화 IRI 유발 조직의 기능 장애의 주요 기능입니다. 영향을받는 조직 중 26 microcirculation가 염증 발병에 대한 통합 사이트로 간주됩니다. 이외에도 이러한 흐름 챔버 assays 27, 28 등 전직 생체내 실험에서 더 나아가 생체내 관련에서 평가하는 intravital 이미징 잘 창업 모델을 제공할 의무이다. IRI는 여러…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 SU Eisenhardt로 "도이치 Forschungsgemeinschaft"(EI 866/1-1)의 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
Referências
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Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle. J. Vis. Exp. (66), e3973, doi:10.3791/3973 (2012).