Real-time Digital bildbehandling av leukocyt-endotel interaktion i ischemi-reperfusionsskada (IRI) i råtta kremastermuskeln
Summary
Digital intravital epifluorescensmikroskopi av postkapillära venoler i cremasteric mikrocirkulationen är en bekväm metod för att få insikter i leukocyt-endoteliala interaktionen<em> In vivo</em> I ischemi-reperfusionsskada (IRI) i tvärstrimmig muskelvävnad. Vi erbjuder här ett detaljerat protokoll för att säkert utföra tekniken och diskutera dess tillämpningar och begränsningar.
Abstract
Ischemi-reperfusionsskada (IRI) har implicerats i ett stort arrangemang av patologiska tillstånd, såsom cerebral stroke, myokardinfarkt, intestinal ischemi såväl som efter transplantationskirurgi och kardiovaskulär kirurgi. 1 Reperfusion av tidigare ischemisk vävnad, medan väsentliga för förhindrande av irreversibel vävnadsskada, framkallar överdrivet inflammation i angripna vävnaden. Intill produktion av reaktiva syrespecies, aktivering av komplementsystemet och ökad mikrovaskulär permeabilitet, är aktiveringen av leukocyter en av de principiella aktörer i patologiska kaskad av inflammatorisk vävnadsskada under reperfusion. 2, 3 är leukocytaktivering en flerstegsprocess som består valsningsriktningen, starka adhesion och och medieras av en komplex interaktion mellan adhesionsmolekyler som svar på kemoattraktanter såsom komplementfaktorer, kemokiner, eller blodplättsaktiverande faktor. 4
<p klass = "jove_content"> Medan leukocytrullning i postkapillära venoler huvudsakligen medieras genom interaktion av selektiner 5 med deras motsvarigheter ligander, fast adhesion av leukocyter till endotelet är selektin-styrd via bindning till intercellulära adhesionsmolekyler (ICAM) och vaskulär cellulära adhesionsmolekyler (VCAM) 6, 7Gyllene standarden för in vivo-observation av leukocyt-endoteliala interaktion är tekniken för intravital mikroskopi, som först beskrevs 1968. 8
Fastän olika modeller av IRI (ischemi-reperfusionsskada) har beskrivits för olika organ, 9-12 endast ett fåtal är lämpliga för direkt visualisering av leukocytrekrytering i den mikrovaskulära bädden på en hög nivå av bildkvalitet. 8
Vi främjar här digitala intravital epifluorescensmikroskopi av postkapillära venolen i cremasteric mikrocirkulationenav rått 13 som en bekväm metod för att kvalitativt och kvantitativt analysera leukocytrekrytering för IRI-forskning i tvärstrimmig muskelvävnad och ger en detaljerad handbok för att åstadkomma tekniken. Vi illustrerar ytterligare gemensamma fallgropar och ger användbara tips som ska hjälpa läsaren att verkligen uppskatta, och säkert utföra metoden.
I ett steg för steg protokoll vi skildra hur du kommer igång med andningen kontrollerad anestesi under tillräcklig övervakning för att hålla djuret ordentligt sövd under längre perioder. Vi beskriver sedan cremasteric beredningen som en tunn platt ark för enastående optisk upplösning och ger ett protokoll för leukocyt avbildning i IRI som har väl etablerade i våra laboratorier.
Protocol
Discussion
Leukocyt-endoteliala interaktion, produktion av reaktiva syrespecies och aktivering av komplementsystemet är de viktigaste egenskaperna hos IRI-inducerad vävnad dysfunktion. 26 mikrocirkulationen av den påverkade vävnaden betraktas som integralen platsen för den inflammatoriska debut. Bortsett från ex vivo experiment som analyser flödeskammare 27, 28 är det obligatoriskt att tillhandahålla väl etablerade modeller av intravital avbildning för att ytterligare utvärdera in viv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" för att SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
Referências
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
