여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을 나타냅니다<em> 예 생체</emmorphogenesis, 차별화 및 성장 등의 췌장 개발의 다양한 측면을 공부> 시스템입니다. 췌장 꽃 봉오리의 explants는 며칠 동안 배양 및 전체 마운트 immunofluorescence, 라이브 영상 등의 다양한 응용 프로그램의 범위에서 사용할 수 있습니다.
췌장은 소화 효소와 혈당 수치 1 규제의 생산을 포함한 우리 몸의 중요한 기능을 제어합니다. 지난 십 년간 많은 연구가 췌장 organogenesis을 이해하기위한 견고한 기초에 공헌했지만, 중요한 틈 초기 췌장 형성이 우리의 지식에 유지됩니다. 이러한 초기 이벤트의 전체 이해는이 기관의 개발에 대한 통찰력을 제공하지만, 또한 당뇨병이나 췌장암으로 췌장를 타겟팅하는 불치의 질병으로합니다. 마지막으로,이 정보는 당뇨병의 맥락에서 세포 교체 요법을 개발하기위한 청사진을 생성합니다.
embryogenesis 동안, 췌장 배아 일의 등쪽과 복부 foregut의 endoderm 마우스 배아 3,4에서 (E) 9.5의 고유 한 배아 outgrowths에서 유래 된 것입니다. 두 outgrowths은 단단한 상피 조직으로 주변 mesenchyme에 evaginate완전히 성숙 장기 2,5,6을 생성하기 위해 분기와 차별화, 확산을 받아야 난 꽃 봉오리. 최근 증거는 인슐린 생산 β-세포 등의 췌장 세포 lineages, 성장과 차별화는 분기 췌장 상피 7,8 내의 적절한 조직 아키텍처, 상피 리모델링 및 셀 위치에 따라 달라집니다 것을 제안했습니다. 그러나, morphogenesis을 가지 방법을하면 발생 췌장의 증식과 분화로 조정됩니다 것은 대부분 알 수 있습니다. 이 morphogenetic 이벤트는 매우 동적 한편 개발 프로세스에 대한 최신 지식, 고정 표본의 분석에 거의 대부분 의존 하였다는 사실로 인해 일부입니다.
여기, 우리는 해부 및 개발 췌장 (그림 1)를 직접 시각화를 허용 유리 바닥 요리에 배양 마우스 배아 췌장 꽃 봉오리의 예를 생체에 대한 방법을보고합니다. 이 컬트우레 시스템은 이상적으로 특히, 라이브 셀 이미징에 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 위해 고안하고 있습니다. 췌장 explants가 아니라 야생 타입 마우스 배아에서 준비뿐만 아니라, 유전 공학 마우스 변종 (예 : 유전자 변형 또는 녹아웃)에서 돌연변이 phenotypes의 실시간 연구를 허용 할 수 있습니다. 또한,이 전 생체 문화 시스템은 증식과 성장, 연신율, 브랜칭, tubulogenesis과 차별화에 대한 정량적 데이터를 얻을 수있게 췌장 개발에 화학 화합물의 효과를 연구 할 가치가있다. 결론적으로, 고해상도 영상과 함께 전직 생체의 췌장 explant 문화 방법의 개발은 그들이 개발 마우스의 배아에서 발생하는 morphogenetic과 차별화 이벤트를 관찰위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.
췌장의 운명이 지정되면, 췌장 전구 세포는 결국 성숙하고 기능 오르간 2,4를 형성하기 위해 광범위한 확산, 차별화 및 morphogenesis을 받고있다. 현재 분기하는 방법은 췌장에서 일어난 방법은 전구 증식과 분화에 연결되어 대부분 알 수 있습니다. 췌장 explant 문화는 이러한 프로세스에게 예 생체 5,9,11을 명료하게하다 할 수있는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 초기 췌장 꽃 ?…
The authors have nothing to disclose.
연구 Spagnoli 실험실. Helmholtz 협회, FP7-IRG-2008-ENDOPANC 교부금 및 ERC-2009-시작 HEPATOPANCREATIC 교부금으로 운용되고 있습니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
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Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |