Een systeem voor<em> Ex vivo</em> Kweken van embryonale Pancreas

Summary

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een uitgelezen<em> Ex vivo</em> Systeem voor het bestuderen van verschillende aspecten van de pancreas ontwikkeling, met inbegrip van morfogenese, differentiatie en groei. Pancreas knop explantaten worden enkele dagen gekweekt en gebruikt in een aantal verschillende toepassingen, waaronder geheel gemonteerde immunofluorescentie en live beeldvorming.

Abstract

De alvleesklier controleert vitale functies van ons lichaam, met inbegrip van de productie van spijsverteringsenzymen en de regulering van de bloedsuikerspiegel ^1. Hoewel in de afgelopen tien jaar veel studies hebben bijgedragen aan een solide basis voor het begrijpen van de pancreas organogenese, belangrijke lacunes bestaan ​​in de kennis van de vroege pancreas vorming ^2. Een volledig begrip van deze vroege gebeurtenissen zal inzicht geven in de ontwikkeling van dit orgaan, maar ook in ongeneeslijke ziekten die de alvleesklier te richten, zoals diabetes of alvleesklierkanker. Tenslotte zal deze informatie genereert een blauwdruk voor de ontwikkeling cel-vervangende therapieën in het kader van diabetes.

Tijdens de embryogenese, de alvleesklier is afkomstig van verschillende embryonale uitwassen van de dorsale en ventrale voordarm endoderm op embryonale dag (E) 9,5 in de muis embryo ^3,4. Beide uitwassen evaginate in het omringende mesenchym als vaste epitheell knoppen, die proliferatie ondergaan, vertakking en differentiatie tot een volledig volwassen orgel ^2,5,6 genereren. Recent bewijs heeft gesuggereerd dat de groei en differentiatie van pancreatische cellijnen, zoals de insuline producerende β-cellen, afhankelijk juiste weefsel-architectuur, epitheliale cellen remodellering en positionering binnen de vertakking pancreas epitheel ^7,8. Maar hoe vertakking morfogenese optreedt en gecoördineerd met proliferatie en differentiatie in de pancreas is grotendeels onbekend. Dit is gedeeltelijk te wijten aan het feit dat de huidige kennis over deze processen is bijna uitsluitend op de analyse van vaste monsters, terwijl morfogenetische gebeurtenissen zijn zeer dynamisch.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het ontleden en kweken muis embryonale alvleesklier knoppen ex vivo op glazen schalen, die directe visualisatie van de ontwikkeling pancreas (figuur 1) te maken. Deze cultusure systeem is ideaal ontworpen voor confocale laser scanning microscopie en in het bijzonder levende cellen imaging. Pancreas explantaten kan worden bereid niet alleen uit wildtype muis embryo, maar ook uit genetisch gemanipuleerde muizenstammen (zoals transgene of knock-out), waardoor real-time onderzoek mutant fenotype. Bovendien is deze ex vivo teeltsysteem is waardevol om de effecten van chemische verbindingen op pancreas ontwikkeling te bestuderen, waardoor kwantitatieve gegevens over de proliferatie en groei, rek, vertakking, tubulogenesis en differentiatie te verkrijgen. Kortom, de ontwikkeling van een ex vivo pancreas explantaatkweek methode in combinatie met hoge-resolutie beeldvorming biedt een sterk platform voor het observeren van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen die zich voordoen binnen de zich ontwikkelende muis embryo.

Protocol

De hier beschreven protocol werd aangepast van de techniek oorspronkelijk beschreven in Percival en Slack 9 en geoptimaliseerd voor confocale microscopie. 1. Coating van Glass Bottom Cultuur Gerechten De volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. Pancreas explantaten worden gekweekt in 35-mm petrischalen met 20-mm glas microwell bodem (bijv. MatTek Corporation). Gebruik een glazen…

Discussion

Zodra pancreatic lot is aangegeven, pancreatische progenitorcellen ondergaan uitgebreide proliferatie, differentiatie en morfogenese om uiteindelijk een rijpe en functionele orgaan ^2,4. Momenteel hoe vertakking plaatsvindt in de pancreas en hoe het is aangesloten progenitor proliferatie en differentiatie is grotendeels onbekend. Pancreas explantatie culturen vormen een ideaal systeem om op te helderen deze processen ex vivo ^5,9,11. Door de combinatie van live-cell imaging met ex vivo</…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1