のためのシステム<em> ex vivoで</em胚膵臓>培養

Summary

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し<em> ex vivoで</em形態形成、分化、成長を含む膵臓開発のさまざまな側面を研究するための>システム。膵原外植片は、数日間培養し、ホールマウント蛍光免疫とライブイメージングなど、さまざまなアプリケーションの範囲で使用することができます。

Abstract

膵臓は消化酵素の生産と血糖値¹の規制を含め、私たちの体の重要な機能を制御します。過去10年間に多くの研究では、膵臓の器官形成を理解するための強固な基盤に貢献してきたが、重要なギャップが早期膵臓形成の²の我々の知識に固執する。これらの初期のイベントの完全な理解は、この臓器の開発への洞察を提供するだけでなく、糖尿病や膵臓癌などの膵臓をターゲット難病、になります。最後に、この情報は、糖尿病との関連で、細胞補充療法を開発するための青写真を生成します。

胚発生時、膵臓はマウス胚における^3,4日胚（E）は9.5で、背側と腹側前腸内胚葉の異なる胚の増生に由来する。両方の派生物は、固体として周囲の上皮間葉に裏返しにする完全に成熟した器官^2,5,6を生成するために、分岐や分化、増殖を受けるリットルの芽、。最近の証拠は、インスリン産生β細胞を含む膵臓細胞系譜、の成長や分化、分岐膵臓上皮^7,8内の適切な組織アーキテクチャ、上皮リモデリングと細胞の位置に依存していることを示唆している。しかし、分枝形態形成方法と発生し、膵臓の増殖と分化との間で調整されているほとんど知られていない。これは、形態形成のイベントは非常に動的でありながら、これらの発達過程に関する現在の知識は、固定された試料の分析にほぼ独占的に依存してきたという事実のために一部になっています。

ここでは、開発膵臓（ 図1）の直接可視化を可能にするガラスボトムディッシュ上でex vivoで解剖し、培養マウス胚膵芽する方法について検討する。このカルトUREシステムは、理想的には、特に、ライブセルイメージング共焦点レーザー走査顕微鏡と、ために考案されています。膵臓外植片だけでなく、野生型マウスの胚から調製しただけでなく、遺伝子組み換えマウス系統（ 例えば、トランスジェニックやノックアウト）から、変異体の表現型のリアルタイムの研究を可能にすることができます。また、このex vivoで培養系は 、増殖、成長、伸長、分岐、細管形成と分化に関する定量的なデータを取得できるように、膵臓の開発に化学化合物の効果を研究するために貴重なものです。結論として、高分解能イメージングを組み合わせるex vivoでの膵臓移植片培養法の開発は、彼らが開発したマウス胚の中で発生した形態形成と分化のイベントを観察するための強力なプラットフォームを提供します。

Protocol

ここで説明されたプロトコルは、もともとパーシバルとスラック9に記載されており、共焦点顕微鏡検査用に最適化手法から適応されています。 1。グラスボトム培養皿のコーティング次の手順は、層流フード内の無菌条件下で行われるべきである。 膵臓外植片を直径20mmガラス底マイクロウェル（ 例えばマテック株式会社）と3…

Discussion

膵臓運命が指定されると、膵臓前駆細胞は、最終的に成熟しており、機能的な臓器^2,4を形成するために大規模な増殖、分化、形態形成を受ける。現時点では、分岐方法は、膵臓で行われ、それがどのように前駆細胞の増殖と分化に接続されているほとんど知られていない。膵臓外植培養は 、ex vivo ^5,9,11、これらのプロセスを解明するための理想的なシステムを表します…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1