Et system for<em> Ex vivo</em> Dyrking av Embryonic Pancreas

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering, kultur og manipulering av mus embryonale bukspyttkjertelen. Dette representerer et utmerket<em> Ex vivo</em> System for å studere ulike aspekter av bukspyttkjertelen utvikling, inkludert morphogenesis, differensiering og vekst. Bukspyttkjertelen bud explants kan dyrkes i flere dager og brukes i en rekke forskjellige programmer, inkludert hel-mount immunfluorescens og live imaging.

Abstract

Bukspyttkjertelen styrer vitale funksjoner i kroppen vår, inkludert produksjon av fordøyelsesenzymer og regulering av blodsukkeret ^en. Selv i det siste tiåret mange studier har bidratt til et solid fundament for å forstå bukspyttkjertelen organogenese, viktige hull vedvarer i vår kunnskap om tidlig bukspyttkjertelen formasjon ^2. En fullstendig forståelse av disse tidlige hendelser vil gi innsikt i utviklingen av dette organet, men også i uhelbredelige sykdommer som er rettet mot bukspyttkjertelen, som diabetes eller kreft i bukspyttkjertelen. Til slutt, vil denne informasjonen generere en blåkopi for å utvikle celle-erstatning terapi i sammenheng med diabetes.

Under embryogenesen stammer bukspyttkjertelen fra forskjellige embryonale utvekster av dorsal og ventral forutgående endoderm på embryonale dag (E) 9.5 i musen embryo ^3,4. Begge utvekster evaginate i det omkringliggende mesenchyme som solid epithelial knopper, som gjennomgår spredning, forgrening og differensiering for å generere et fullt moden organ ^2,5,6. Nylige bevis har antydet at vekst og differensiering av bukspyttkjertelen celle linjene, inkludert insulin-produserende β-celler, avhengig av riktig vev-arkitektur, epitelisk ombygging og celle posisjonering innen den forgrenede bukspyttkjertelen epitel ^7,8. Men hvordan forgrening morphogenesis oppstår og er koordinert med spredning og differensiering i bukspyttkjertelen er i stor grad ukjent. Dette er delvis på grunn av det faktum at dagens kunnskap om disse utviklingsprosesser har lettelse nesten utelukkende på analyse av faste prøver, mens morfogenetisk hendelser svært dynamiske.

Her, rapporterer vi en fremgangsmåte for dissecting og dyrking mus embryonale bukspyttkjertelen knopper ex vivo på glassbunn retter, som tillater direkte visualisering av fremkallende bukspyttkjertelen (figur 1). Denne kultenure systemet er ideelt utviklet for konfokal laserskanning mikroskopi og, i særdeleshet, live-celle bildebehandling. Pankreatisk eksplanter kan fremstilles ikke bare fra villtype mus embryoer, men også fra genmanipulerte muselinjer (f.eks transgen eller knockout), slik sanntidsdata studier av mutante fenotyper. Dessuten er denne ex vivo kultursystem verdifullt å studere effektene av kjemiske forbindelser på bukspyttkjertelen utvikling, slik å skaffe kvantitative data om spredning og vekst, forlengelse, forgrening, tubulogenesis og differensiering. I konklusjonen, gir utviklingen av en ex vivo bukspyttkjertelen eksplantering kultur metode kombinert med høy oppløsning en sterk plattform for å observere morfogenetisk og differensiering hendelser som de oppstår innenfor utvikling musen embryo.

Protocol

Protokollen er beskrevet her har blitt tilpasset fra teknikken opprinnelig beskrevet i Percival og slakk 9 og optimalisert for konfokal mikroskopi. 1. Belegg av Glass Bottom kultur retter Følgende trinn bør utføres under sterile betingelser i en laminær strømningshette. Bukspyttkjertelen explants dyrkes i 35-mm petriskåler med 20-mm diameter glass mikrobrønn bunnen (f.eks Mattek Corporation). Bruk ett glass nederst parabolen …

Discussion

Når bukspyttkjertelen skjebne er spesifisert, bukspyttkjertelen stamceller gjennomgår omfattende spredning, differensiering og morphogenesis til slutt danne en moden og funksjonell organ ^2,4. I dag, tar hvordan forgreininger sted i bukspyttkjertelen, og hvordan den er koblet til stamcellemobilisering proliferasjon og differensiering er stort sett ukjent. Bukspyttkjertelen Eksplantasjon kulturer representerer et ideelt system for å belyse disse prosessene ex vivo ^5,9,11. Ved å kombinere…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1