Häri beskrivs en robot strategi för hög genomströmning kristallisation av membranproteiner i lipida mesofaser för användning i strukturbestämning med makromolekylär röntgenkristallografi. Tre robotar som klarar den viskösa och klibbiga protein-lastad mesofas integrerad metoden införs.
Struktur-funktion studier av membranproteiner stor nytta av att ha tillgängliga högupplösta 3-D strukturer av den typ som tillhandahålls genom makromolekylär röntgenkristallografi (MX). En väsentlig ingrediens i MX är en stadig tillförsel av helst diffraktion kvalitet kristaller. Den i meso-eller lipidisk kubisk fas (LCP) metod för att kristallisera membranproteiner är en av flera metoder som finns tillgängliga för kristallisering membranproteiner. Den använder sig av en bikontinuerlig mesofas att växa kristaller. Som metod, har det haft några spektakulära framgångar sent och har rönt stor uppmärksamhet med många forskargrupper nu intresserade av att använda den. En av utmaningarna i samband med metoden är att webbhotell mesofasen är extremt trögflytande och klibbig, påminner om en tjock tandkräm. Således dispensering det manuellt på ett reproducerbart sätt i små volymer till kristallisation brunnar kräver skicklighet, tålamod och en stadig hand. Ett protokoll för att göra just som utvecklades i membranet Structural & Funktionell biologi (MS & FB) Grupp 1-3. Jove video artiklar som beskriver metoden är tillgängliga 1,4.
Den manuella metoden för att ställa upp i meso studier har klara fördelar med specialitet applikationer, såsom kristall optimering och derivatisering. Det lider emellertid från att vara en låg genomströmning metod. Här visar vi ett protokoll för att utföra i meso kristallisering prövningar robot. En robot erbjuder fördelarna med snabbhet, exakthet, precision, miniatyrisering och att kunna arbeta kontinuerligt under längre perioder under vilka kan betraktas som fientliga förhållanden såsom i mörkret, i en reducerande atmosfär eller vid låga eller höga temperaturer. En i meso robot, när de används på rätt sätt, kan avsevärt förbättra produktiviteten hos membranprotein struktur och funktion forskning genom att underlätta kristallisering som är en av de långsamma stegen iövergripande strukturen bestämning rörledning.
I den här videon artikeln visar vi att använda tre kommersiellt tillgängliga robotar som kan undvara det viskösa och klibbiga mesofas integrerad i meso crystallogenesis. Den första roboten utvecklades i MS & FB Grupp 5,6. De andra två har nyligen blivit tillgängliga och ingår här är komplett.
En översikt av protokoll behandlas i denna artikel visas i fig 1. Alla manipulationer utfördes vid rumstemperatur (~ 20 ° C) under omgivningsbetingelser.
I denna video artikeln har vi visat hur man använder en robot för att automatiskt ställa in i meso kristallisation försök i 96-brunnar glas sandwich med en protein-lastad lipidisk mesofas. De robotar som används i detta arbete var speciellt utformade för att inkludera en positiv förskjutning spruta glas för noggrann och reproducerbar leverans av metod i nanoliter volymer av den viskösa och klibbiga mesofas, såsom ursprungligen beskrivits 7.
Noggrannhet och precision är viktiga inslag i en robot. Men dessa egenskaper är bara så bra som den grad till och korrekthet som robot prestanda utvärderas och kalibrering utförs. Det säger sig självt att prestandan av roboten bör utvärderas medan enskilda plattor håller på att upprättas. Det är inte lämpligt att anta att roboten fungerar felfritt och lämna roboten att köra utan uppsikt. Den uppmärksamma och observant aktör bör vara i en position att notera med ett ljud eller ett utseende när något inte fungerar och att rätta till det genast. Dessutom bör varje platta noggrant inspekteras med ögat för enhetliga och innehåll, så snart som plattan förseglas och innan den ställs undan för kristallisation försök. Detta bör endast kräver några sekunder att utföra och kan göras medan nästa platta laddas. Märker, till exempel, kan det vissa brunnar inte korrekt ifyllda belysa det faktum att en viss fällningsmedel tubens spets fungerar inte. Skulle leverans av mesofas ses vara oregelbunden, skulle den relevanta felaktiga posten måste korrigeras omedelbart. Genom att notera dessa frågor och göra de relevanta justeringarna under uppsättningen kommer att spara tid och material, inklusive värdefull lipid och membranprotein. Om en kameran används för att spåra kristalltillväxt, kan noggrannhet och precision även övervakas under avbildning. Till exempel systematiska problem med droppe eller bolusläge vid imager visar att något inte står rätt och att korrigerande åtgärder någonstans uppströms i protokollet behövs.
I syfte att tillförlitlig prestanda därför roboten måste kalibreras på ett regelbundet schema och behov. Kalibreringar bör omfatta volymen av fällningsmedel och mesofas levereras liksom bolus och fällningsmedel placering i brunnen. Självklart bör i möjligaste mån kalibrering göras med hjälp av volymer och material som liknar dem som kommer att användas i försök utförda i den period som den kvalitetskontrollen.
Lika viktigt som kalibrering så också är med i lager ett tillräckligt utbud av robotdelar och tillbehör. Katastrofala och oväntade fel, blockeringar och krascher kan och göra uppstå. I ett sådant fall, med tillgång till en ersättare fällningsmedel leverans spets, till exempel, kan innebära att en extremt värdefull membranprotein preparat används som det ska ochinte slösas bort.
Några av fördelarna med en robot innefattar det faktum att det kommer att fungera väsentligen kontinuerligt och att det inte lider av eller "klagar över" trötthet. En robot kan också användas under förhållanden som inte anses människa-vänlig, som i mörkret under kontrollerade belysning och miljöförhållanden, och vid extrema temperaturer. Robotarna visade i denna artikel har alla används under omgivningsförhållanden vid ~ 20 ° C. Men det är proteiner och projekt som kräver icke-omgivningstemperaturer, kontrollerad ljus 11,12 och en oxiderande eller en reducerande miljö 13. Alla dessa kan tillgodoses, med relativ lätthet, då en kristallisering robot används.
I en tidigare JUPITER video artikel vi visade hur kristallisation försök från i meso metoden sätts upp manuellt 1. Den minsta mängd mesofas som kan dispenseras tillförlitligt hand är begränsad by synskärpa och stadig hänthet den person inrätta försöken. Enligt vår erfarenhet är volymer mesofas så låga som 100 nl lätt att hantera. Vi känner en labbet där standardvolymen doseras manuellt är ca 40 nl. Men betydligt mindre volymer är möjliga med hjälp av en robot. Separat, har vi visat att mesofas volymer så låga som 550 pikoliter kan dispenseras robot 14. Från det arbetet stod det klart att ytterligare miniatyrisering av roboten är möjligt som, om de genomförs, skulle leda till en stor minskning av mängden värdefulla membranprotein som behövs för att genomföra en kristallisation rättegång.
I den här videon artikeln har tre kommersiellt tillgängliga robotar som används för att påvisa hög kapacitet kristallisering membranprotein med lipida mesofaser. Den första av dessa har utvecklats i MS & FB-gruppen baserat på vår erfarenhet inrättande försök manuellt, vilket beskrivs i JUPITER 1712 1. Detta är instrumentetsning har vi mest kännedom och huvuddelen av den aktuella artikeln ägnas åt dess användning. De andra två robotar var på demonstrationen i MS & FB-gruppen vid tidpunkten för artikeln skrevs och relevant film ingår här med tanke på fullständighet. Alla tre robotar använder mycket samma mesofasen dosering system, huvudsakligen kännetecknas av en positiv förskjutning glasspruta 5,7. De skiljer sig mest markant när det gäller fällningsmedel leverans. Robotar 1 och 2 kan fördela fällningsmedel samtidigt i 8 brunnar, en enda kolumn på en kristallisering platta i taget. Däremot avstår Robot 3 alla 96 fällningsmedel lösningar i en enda åtgärd. Robot 2 är det enda instrumentet med engångs utfällande utlämning tips. Det finns för-och nackdelar som är förknippade med de olika instrumenten som är beroende på den speciella tillämpningen, dessa kommer inte att utarbetas på här. Det räcker med att säga att alla tre arbete och har producerat kristaller av migmbrane proteiner från i meso metoden.
Nästa steg i den övergripande processen strukturbestämning genom makromolekylär kristallografi är att skörda och kryo-cool kristaller från plattor som inrättats enligt denna video artikeln och registreras och behandlas röntgendiffraktion från dem. Dessa ämnen behandlas i separata Jove artiklar i denna serie 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Det finns många som har bidragit till detta arbete och de flesta är från membranet strukturell och funktionell biologi Group både tidigare och nuvarande medlemmar. Till alla vi varmt tack och uppskattning. Detta arbete stöddes delvis av anslag från vetenskapsrådet Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 och U54GM094599) och FP7 COST Action CM0902.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |