Ici est décrit procédures mises en place dans la membrane Caffrey structurale et fonctionnelle du Groupe Biologie des cristaux de récolte et de cryo-cool protéines membranaires lipidiques cultivés dans des phases cubiques et une éponge pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l'aide cristallographie aux rayons X.
Une voie importante pour comprendre comment les protéines fonctionnent à un niveau mécanistique, c'est d'avoir la structure de la protéine cible disponible, idéalement avec une résolution atomique. Actuellement, il n'existe qu'une seule façon de recueillir de l'information telle qu'appliquée à des protéines membranaires intégrales (Figure 1), et les complexes qu'ils forment, et que cette méthode est macromoléculaire cristallographie aux rayons X (MX). Pour ce faire cristaux MX qualité de diffraction sont nécessaires qui, dans le cas des protéines membranaires, ne forment pas facilement. Une méthode de cristallisation de protéines membranaires qui implique l'utilisation de mésophases lipidiques, en particulier les phases cubiques et éponge 1-5, a gagné une attention considérable en raison de la fin des succès qu'il a eu dans le domaine G du récepteur couplé aux protéines 21.06 ( www . mpdb.tcd.ie ). Cependant, la méthode, ci-après dénommé le méso ou dans lipidique méthode de phase cubique, est livré avec son propre techniquedéfis. Celles-ci proviennent, en partie, en raison de la nature généralement visqueuse et collante de la mésophase lipidique dans laquelle les cristaux, qui sont souvent des micro-cristaux, grandir. Manipulation des cristaux devient difficile en raison, en particulier pendant la récolte afin 22,23. Des problèmes se posent aussi à l'étape qui précède la récolte, qui exige que les plaques sandwich de verre dans laquelle les cristaux se développent (figure 2) 24,25 sont ouvertes pour exposer le bolus mésophase, et les cristaux y sont, pour la récolte, cryo-refroidissement et X éventuels diffraction des rayons collecte de données.
Les variantes mésophases cubiques et une éponge (figure 3) à partir de laquelle les cristaux doivent être récoltés ont profondément différentes rhéologies 4,26. La phase cubique est visqueuse et collante semblable à une pâte dentifrice d'épaisseur. En revanche, la phase éponge est plus fluide avec une nette tendance à couler. En conséquence, les différentes approches pour l'ouverture de cristallisation puits containing cristaux poussent dans le cube et la phase éponge sont appelés pour aussi bien des méthodes différentes sont nécessaires pour la récolte des cristaux à partir des deux types de mésophase. Protocoles pour faire juste cela ont été affinés et mis en œuvre dans la membrane Biologie Structurale et Fonctionnelle (MS & FB), et sont décrits en détail dans cet article JoVE (figure 4). Des exemples sont donnés de situations où les cristaux sont récoltés avec succès et cryo-refroidi. Nous fournissons également des exemples de cas où des problèmes se posent qui conduisent à la perte irrémédiable de cristaux et de décrire la façon dont ces problèmes peuvent être évités. Dans cet article, le Viewer est fourni avec étape par étape les instructions pour l'ouverture de puits de verre en sandwich de cristallisation, pour la récolte et pour cryo-refroidissement des cristaux de protéines membranaires qui poussent dans des phases cubique et d'éponges.
Dans cet article, nous avons montré comment la vidéo cristaux cultivés dans une mésophase lipidique sont récoltées et cryo-refroidi en préparation pour une utilisation dans la collecte des données de diffraction et en fin de compte pour la détermination de la structure. La mésophase hébergement peut être la phase visqueuse et collante cubique ou la phase éponge plus fluide 4. Comment les plaques sandwich de verre sont ouverts et la façon dont les cristaux sont récoltés dépend beaucoup du type de mésophase. Il est donc important de savoir qui de l'un deux a affaire à l'avance. L'identité de l'hébergement des lipides et le précipitant utilisé est importante à cet égard, et l'apparence physique des bolus mésophase dans la cristallisation et peut être utilisée pour les distinguer (figure 3). La récolte de ces deux types de mésophase a été illustrée dans cet article.
La récolte de petits cristaux d'une mésophase lipidique dans les plaques sandwich de verre est un processus laborieux qui nécessite du temps, des compétences, expertiseience, de la patience et une main ferme. Il est important de mettre de côté une quantité appropriée de temps pour la récolte et de mettre en place le laboratoire de sorte que toutes les fournitures et les équipements sont à portée de main à l'avance. Une deuxième personne pour aider à la récolte n'est pas indispensable mais est recommandée. Cette personne peut vous aider à fournir des plaques pré-marqués à l'individu de faire la récolte ainsi que de placer cryo-refroidis boucles montées avec des cristaux récoltés dans la rondelle de stockage. L'assistant peut également jouer un rôle de soutien important dans la documentation des observations sur les cristaux faites au cours de la récolte qui pourrait s'avérer crucial lors de la collecte des données de diffraction. En l'absence d'une assistante, commande vocale enregistrement audio dispositif pourrait être mis à profit pour la documentation.
En suivant le protocole décrit dans cet article vous aidera à faire la visionneuse lever et courir avec la récolte de cristal. Cependant, il est important de comprendre que le processus n'est pas simple et que practice est nécessaire avant de se lancer dans la récolte de précieux cristaux de protéines membranaires. Il est donc recommandé que les plaques d'essai avec des cristaux de protéines qui ne sont pas particulièrement utiles être expérimenté en premier lieu. Ce sera le néophyte avec une expérience précieuse dans la découpe du verre, l'élimination des tessons de verre, en soulevant le couvre-objet à partir de plus de la mésophase, en utilisant la caractéristique de polarisation sur le microscope pour voir les cristaux et de les suivre au cours de la récolte, et enfin traiter les différents types de mésophases et la récolte de leur part. La texture de la mésophase, et par extension de la facilité avec laquelle les cristaux peuvent être récoltés, qui change avec le temps pendant la cristallisation. Il est donc important de pratiquer la récolte de cristaux de moindre valeur, mais avec ceux qui ont grandi dans les mêmes conditions que celles de plus grande valeur. Il est possible de faire croître des cristaux de lysozyme et la thaumatine par le méso ou pt phase cubique lipidique méthode 28 et ceux-ci devraient être consiEred par voie de se familiariser avec les matériaux et la méthode. On devrait aussi envisager de travailler avec des protéines sans mésophase premier à apprendre de ses caprices.
Les procédures démontré ici ont toutes été faites à un niveau confortable de 20 ° C environ. Il est possible de faire croître des cristaux par la méthode de méso à des températures plus basses. Ainsi, monooléine que le lipide hébergement dans un état de phase métastable peut être utilisée à 4 ° C 1,2,29,30. Une alternative est d'utiliser la conception rationnelle 7.9 MAG pour la cristallisation à basse température 31. Nous faisons crysallogenesis basse température couramment avec certains objectifs de protéines membranaires. Dans ce cas, la croissance des cristaux et la récolte se fait de plain-pied réfrigérateur à 4 ° C. Travailler dans de telles conditions a ses propres défis non la moindre, est la nécessité pour les vêtements chauds et confortables.
La prochaine étape dans le processus global de détermination de la structure à l'aide crys macromoléculairestallography est de recueillir des données de diffraction sur des cristaux récoltés et composant logiciel enfichable refroidi comme l'a démontré dans cet article. Dans méso-adulte cristaux sont généralement de petite taille. Toutefois, la collecte de données utiles de diffraction a été possible avec des cristaux ayant une dimension maximale de 20 um 9. A cet effet, les micro-faisceau synchrotron de rayons X est utilisé et fait l'objet d'un article séparé JoVE dans cette série 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Nombreux sont ceux qui ont contribué à ce travail et la plupart sont de la Caffrey membrane structurale et fonctionnelle groupe de biologie, les deux membres passés et présents. Pour tous, et surtout à Jingquan Tan et Joseph Lyons, nous adressons nos plus vifs remerciements et son appréciation. Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), le National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 et U54GM094599), et le 7e PC COST et Actions Marie Curie (CM0902 et PIEF-GA-2009 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |