Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.
Un percorso importante per capire come le proteine funzionano ad un livello meccanicistico è quello di avere la struttura della proteina bersaglio disponibile, idealmente a risoluzione atomica. Attualmente, vi è solo un modo per acquisire informazioni come applicato alle proteine integrali di membrana (Figura 1), ed i complessi che formano, e questo metodo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). Per fare MX cristalli qualità di diffrazione sono necessari che, nel caso delle proteine di membrana, non formano facilmente. Un metodo per cristallizzare proteine di membrana che prevede l'utilizzo di mesofasi lipidiche, in particolare le fasi cubi e spugna 1-5, ha guadagnato una notevole attenzione a causa del ritardo per i successi che ha avuto nella proteina-recettore accoppiato campo G 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Tuttavia, il metodo, d'ora in poi denominato in meso o lipidica metodo fase cubica, viene fornito con il proprio tecnicosfide. Questi derivano, in parte, a causa della natura generalmente viscoso e appiccicoso della mesofase lipidico in cui i cristalli, che sono spesso microcristalli, crescono. Manipolando cristalli diventa difficile a causa e in modo particolare durante la raccolta 22,23. Sorgono problemi anche nella fase che precede la raccolta che richiede che le lastre di vetro sandwich in cui i cristalli crescono (Figura 2) 24,25 sono aperte per esporre il bolo mesofase, ed i cristalli in esso, per la raccolta, crio-raffreddamento e X eventuali diffrazione raccolta dati.
Le varianti mesofase cubi e spugna (Figura 3), da cui cristalli devono essere raccolti hanno reologie profondamente diversi 4,26. La fase cubica è viscoso e appiccicoso simile a un dentifricio spessore. Per contro, la fase spugna è più fluido con una spiccata tendenza a flusso. Di conseguenza, i diversi approcci per l'apertura di pozzi cristallizzazione containing cristalli crescono nel cubo e la fase spugna sono chiamati a effetti diversi metodi sono necessari per la raccolta di cristalli dai due tipi mesofase. Protocolli per fare proprio che sono state perfezionate e attuate nella membrana Biologia Strutturale e Funzionale (MS & FB) del Gruppo, e sono descritte in dettaglio in questo articolo JoVE (Figura 4). Alcuni esempi sono riportati di situazioni in cui i cristalli sono raccolti con successo e crio-raffreddato. Forniamo anche esempi di casi in cui sorgono problemi che portano alla perdita irrimediabile di cristalli e descrivere come questi problemi possono essere evitati. In questo articolo il Viewer è dotato di passo-passo le istruzioni per l'apertura di pozzi di cristallizzazione a sandwich di vetro, per la raccolta e per la crio-raffreddamento cristalli di proteine di membrana che crescono in cubi e nelle fasi spugna.
In questo articolo il video abbiamo dimostrato come i cristalli coltivati in un mesofase lipidico sono stati raccolti e crio-raffreddata in preparazione per l'uso nella raccolta dei dati di diffrazione e, infine, per la determinazione della struttura. Mesofase hosting può essere la fase viscoso e appiccicoso cubica o la fase spugna più fluido 4. Come le lastre di vetro a sandwich sono aperte e come i cristalli sono raccolti molto dipende dal tipo di mesofase. E 'importante quindi sapere quale dei due è quello che fare con anticipo. L'identità del lipide hosting e il precipitante utilizzati sono importanti in questo senso, e l'aspetto fisico del bolo mesofase nella cristallizzazione bene può essere usato per distinguerli (Figura 3). Raccolta da entrambi i tipi mesofase è stato illustrato in questo articolo.
Raccolta piccoli cristalli da un mesofase lipidica in superfici di vetro di vetro è un faticoso processo che richiede tempo, abilità, compeience, pazienza e una mano ferma. E 'importante mettere da parte una quantità di tempo adeguato per la raccolta e per impostare il laboratorio in modo che tutte le forniture e le attrezzature sono a portata di mano in anticipo. Una seconda persona con raccolta non è essenziale, ma è consigliabile. Quella persona può aiutare con la fornitura di pre-marcate le piastre per l'individuo a fare la raccolta e l'immissione anelli montati crio-raffreddati con cristalli raccolti nel disco di archiviazione. L'assistente può anche svolgere un ruolo importante di supporto nel documentare osservazioni sui cristalli effettuate durante la raccolta che potrebbe rivelarsi cruciale durante la raccolta dei dati di diffrazione. In assenza di un assistente, un comando vocale audio-dispositivo di registrazione può essere vantaggiosamente utilizzato per la documentazione.
Dopo il protocollo descritto in questo articolo vi aiuterà a ottenere il visualizzatore installato e funzionante con la raccolta di cristallo. Tuttavia, è importante sottolineare che il processo non è semplice e che practice è necessario prima di lanciarsi nella raccolta preziosi cristalli di proteine di membrana. Si raccomanda pertanto che le targhe di prova con cristalli di proteine che non rappresentano un particolare valore essere sperimentato prima. Ciò fornirà il neofita preziosa esperienza nel taglio del vetro, rimuovendo frammenti di vetro, sollevando il coprioggetto da oltre mesofase, utilizzando la funzione polarizzante sul microscopio per vedere cristalli e di rintracciarli durante la raccolta, movimentazione e infine i diversi tipi di mesofasi e la raccolta da loro. La trama del mesofase, e per estensione la facilità con cui i cristalli possono essere raccolti, cambia con il tempo durante la cristallizzazione. E 'importante quindi di praticare la raccolta con cristalli di minor valore, ma con quelli che sono cresciuti nelle stesse condizioni come quelle di maggior valore. È possibile far crescere cristalli di lisozima e taumatina dal meso o de lipidica metodo fase cubica 28 e questi dovrebbero essere consideEred a titolo di guadagnare familiarità con i materiali e il metodo. Si dovrebbe anche prendere in considerazione di lavoro con privo di proteine mesofase primo a conoscere dei suoi capricci.
Le procedure hanno dimostrato qui erano tutti fatto in un confortevole 20 ° C o giù di lì. È possibile far crescere cristalli dal metodo in meso a temperature inferiori. Così, monoolein come lipidi hosting in uno stato di fase metastabile può essere utilizzato a 4 ° C 1,2,29,30. Un'alternativa è quella di utilizzare il razionalmente 7,9 MAG per cristallizzazione a bassa temperatura 31. Facciamo crysallogenesis bassa temperatura di routine con gli obiettivi di alcune proteine di membrana. In questo caso, la crescita dei cristalli e la raccolta è fatta in un walk-in frigorifero a 4 ° C. Lavorare in queste condizioni ha le sue sfide non ultimo dei quali è la necessità di un abbigliamento caldo e confortevole.
Il passo successivo nel processo generale di determinazione della struttura con cristalli macromolecolaritallography è quello di raccogliere dati di diffrazione su cristalli raccolti e snap-raffreddato, come illustrato in questo articolo. Nel meso-grown cristalli sono solitamente di piccole dimensioni. Tuttavia, utile raccolta dati di diffrazione è stato possibile con cristalli aventi una dimensione massima di 20 micron 9. A questo scopo, micro-beam X-radiazione di sincrotrone viene utilizzata ed è al centro di un articolo separato JoVE in questa serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti, e soprattutto per Jingquan Tan e Joseph Lyons, estendiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e il 7PQ COST e azioni Marie Curie (CM0902 e Pief-GA-2009 -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |