本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。
タンパク質は機械論的レベルでどのように機能するかを理解するための重要なルートでは、理想的には、原子レベルの分解能で、利用可能な標的タンパク質の構造を持つことである。現在、そこに内在性膜タンパク質( 図1)、それらが形成する複合体に適用されるような情報をキャプチャするための唯一の方法であり、その方法は、高分子のX線結晶構造解析(MX)です。行うためにMX回折品質結晶は、膜タンパク質の場合には、容易に形成しないような、必要とされている。脂質メソフェーズ、特に立方とスポンジのフェーズ1-5の使用を含む膜タンパク質を結晶化させるための方法は、(それは、Gタンパク質共役型受容体のフィールド6-21できた成功に遅れにより、かなりの注目を集めているWWW 。mpdb.tcd.ie )。しかし、今後メソ又は脂質立方相メソッドでと呼ばれる方法は、独自の技術が付属しています課題。これらは、しばしば微細結晶である結晶は、成長する脂質メソフェーズの一般に粘性と粘着性の性質のために、部分的に発生する。結晶を操作すると、22,23の収穫時に結果として難しいと特にそうなります。問題は24,25を 、収穫のために、その中に極低温冷却と最終的なXをメソフェーズボーラスを公開するために開設し、結晶されています( 図2)の結晶が成長するガラスサンドイッチプレートのことを要求しており、収穫に先行段階であまりにも生じる線回折データを収集します。
結晶が収穫されている必要があり、そこから立方晶とスポンジメソフェーズ変異体( 図3)は大いに異なるレオロジー4,26を持っています。立方相は、粘性と太い歯磨き粉に付箋似ています。これとは対照的に、スポンジ相は流れに明確な傾向がより流動的です。開口部結晶化のための井戸containiしたがって、異なるアプローチキュービックとスポンジの段階で成長ngの結晶は確かに別の方法が2メソフェーズタイプから結晶を収穫に必要であるように求められています。洗練され、実装メンブレン構造·機能生物学(MS&FB)のグループで、このJoveの記事( 図4)に詳細に記載されているされているだけで行うためのプロトコル。例としては、結晶が正常に収穫し、低温に冷却されている状況を説明しています。我々はまた、問題は結晶の取り返しのつかない損失にそのリードを生じる例の例を提供し、これらの問題を回避することができる方法を説明します。この記事ではビューアをガラスサンドイッチ結晶井戸を開くため、収穫のため、立方とスポンジの段階で成長している膜タンパク質の結晶クライオ冷却するためのステップバイステップの手順が設けられている。
このビデオの記事では、脂質メソフェーズに成長した結晶を採集し、回折データ収集で使用するための準備のために、最終的に構造決定のための極低温に冷却される方法を紹介しました。ホスティングメソフェーズは粘性及び粘着性の立方相以上の流体スポンジフェーズ4になることができます。ガラスサンドイッチプレートが開かれている方法と結晶は非常に収穫される方法と、メソフェーズタイプによって異なります。それは前もって扱っている2つのかを知ることが重要である。ホスティング脂質の身元と使用沈殿剤はこの点で重要であり、結晶化メソフェーズボーラスの物理的な外観は、よく( 図3)それらを区別するために使用できます。両方メソフェーズタイプから収穫は、この資料で説明された。
ガラスサンドイッチプレート中脂質メソフェーズから小さな結晶を収穫するには、時間、スキル、experを必要とする骨の折れるプロセスです。ience、忍耐と着実に手。収穫のための適切な時間を確保しておくと、すべての物資や機器を事前に手になるように研究室を設置することが重要です。収穫を支援するために二人目は必須ではないが推奨されます。その人は、ストレージパックに収穫された結晶と低温冷却マウントループを置くだけでなく、収穫をして個々に事前にマーキングされたプレートの供給を支援することができます。アシスタントは、回折データ収集中に決定的な証明するかもしれない収穫中に行われた結晶の観測を文書で重要なサポートの役割を果たすことができます。アシスタントが存在しない場合には、音声起動、音声記録装置は、文書化のために有利に使用することができる。
この資料に記載されているプロトコルに従うことで、ビューアを立ち上げて結晶収穫で実行するのに役立ちます。しかし、プロセスは簡単ではありませんし、そのことを理解することが重要であるPRActiceは貴重な膜タンパク質の結晶を収穫に起動する前に必要とされる。それは特に貴重ではないタンパク質の結晶を使用してテストプレートは最初に実験されることをお薦めします。これは、ガラスを切断ガラスの破片を除去し、結晶を見て、収穫の間にそれらを追跡するために、顕微鏡に偏光機能を使用して、中間相の上からカバーガラスを持ち上げ、最後に中間相異なる種類の取扱いには貴重な経験を持つ新米を提供しますと、そこから収穫。メソフェーズの質感、ひいては結晶を収穫することができる容易さは、結晶中に時間の経過とともに変化します。それは価値が低い結晶でなく、より価値のあるものと同じ条件下で増殖させたものと、収穫を実践することが重要である。 メソ又は脂質立方相法28およびこれらで considすべきでリゾチームとタウマチンの結晶を成長させることが可能です材料および方法に精通していることを獲得する方法でパワード。一つは、その気まぐれを知るために第一の無タンパク質メソフェーズでの作業を考慮する必要があります。
ここで示す手順は、すべての快適な20℃またはその辺に行われた。より低い温度でのメソ法によって結晶を成長させることが可能です。したがって、準安定相状態のホスティング脂質としてモノオレインは4℃1,2,29,30で使用することができます。代替案は、低温結晶化のために合理的に設計された31 7.9 MAGを使用することです。我々は、特定の膜タンパク質のターゲットで日常的に低温crysallogenesisを行う。このケースでは、結晶成長と収穫はウォークイン4℃の冷蔵庫内で行われます。このような状況下で働くことは暖かく、快適な服装の必要性ではなく、少なくともそのうち独自の課題があります。
高分子CRYSを使用して構造決定する全体的なプロセスの次のステップtallographyは、結晶を回収し、この記事で説明するようにスナップを冷却で回折データを収集することである。 メソ成長結晶中の通常小さいです。しかし、有用な回折データ収集は20μm9の最大寸法を有する結晶では不可能であった。この目的のために、マイクロビームシンクロトロンX線を使用し、このシリーズ32,33の個別のJoveの記事の焦点である。
The authors have nothing to disclose.
この仕事に貢献し、ほとんどがCaffrey膜から構造·機能研究グループ、過去と現在の両方のメンバーである多くの人々があります。すべてに、特にJingquanタンとヨセフライアンズへ、私達は私達の暖かい感謝と感謝の意を。この作品は、アイルランド科学財団(07/IN.1/B1836)、国立衛生研究所(GM75915、P50GM073210とU54GM094599)、およびFP7のコストとマリー·キュリー·アクション(CM0902とPIEF-GA-2009からの助成金によって部分的にサポートされていました-235612)。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |