Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie
Summary
Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.
Abstract
De planarian, een zoetwater platworm, heeft bewezen een krachtig systeem voor het ontleden van metazoïsche regeneratie en stamcel biologie 1,2 te zijn. Planarian regeneratie van ontbrekende of beschadigde weefsels wordt mogelijk gemaakt door volwassen stamcellen genoemd neoblasts 3. Hoewel deze stamcellen is definitief aangetoond dat ze pluripotent en singulier in staat om bij de reconstructie van een heel dier 4, de heterogeniteit binnen de stamcellen bevolking en de dynamiek van hun cellulaire gedrag blijven grotendeels onopgelost. Door het grote aantal en de brede verspreiding van stamcellen in de planarian lichaam plan worden geavanceerde methoden voor het manipuleren van subpopulaties van stamcellen voor Moleculaire en functionele studie in vivo nodig.
Weefseltransplantatie en gedeeltelijke bestraling twee methoden waarbij een subpopulatie van planarian stamcellen kunnen worden geïsoleerd voor verder onderzoek. Elke techniek heeft duidelijke voordelen. Tafgifte transplantatie kan de invoering van stamcellen in een naïeve gastheer die een inherent genetisch verschillende of eerder farmacologisch behandeld. U kunt ook een gedeeltelijke bestraling zorgt voor de isolatie van stamcellen binnen een host, naast elkaar aan het weefsel verstoken van stamcellen, zonder de invoering van een wond of een stuitligging in weefsel integriteit. Met behulp van deze twee methoden kan men onderzoeken de cel autonome en niet-autonome factoren die de controle stamcellen functies, zoals proliferatie, differentiatie en migratie.
Beide weefseltransplantatie 5,6 en gedeeltelijke bestraling 7 zijn van oudsher gebruikt bij het definiëren van veel van de vragen over planarian regeneratie die nog in studie vandaag. Echter, deze technieken bleef als gevolg van de moeizame en inconsistente karakter van de voorgaande methoden onderbenut. De protocollen die hier voorwaarts betekenen een grote stap in het verminderen van de tijd eennd inspanning die nodig is om reproduceerbaar te genereren van grote aantallen geënt of gedeeltelijk bestraalde dieren met efficacies bijna 100 procent. We hebben het de cultuur van grote dieren, immobilisatie, voorbereiding voor gedeeltelijke bestraling, weefseltransplantatie, en het optimaliseren van dierlijke herstel. Bovendien is de hier beschreven werk demonstreert de eerste toepassing van de partiële bestraling werkwijze voor het meest bestudeerd planarian, Schmidtea Mediterranea. Bovendien, efficiënte weefsel enting in planaria opent de deur voor het functioneel testen van subpopulaties van naïeve of behandelde stamcellen in repopulatie assays, die al lange tijd de gouden standaard methode voor het testen van volwassen stamcellen potentieel in zoogdieren 8. Brede acceptatie van deze technieken zal ongetwijfeld leiden tot een beter begrip van de cellulaire gedrag van volwassen stamcellen in weefsel homeostase en regeneratie.
Protocol
Discussion
Het belang van immobilisatie
Immobilisatie verreweg de belangrijkste stap voor de succesvolle voltooiing van een van deze processen. Als planaria zijn niet goed voor een gedeeltelijke bestraling geïmmobiliseerd, kan ze bewegen onder de leiding schild, het produceren van inconsistente en verwarrende resultaten. Bovendien, als dieren worden onvoldoende geïmmobiliseerd na transplantatie, zal de gastheer worm waarschijnlijk af te stappen van het transplantaat weefsels, wat resulteert in het falen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Chiyoko Kobayashi en Kiyokazu Agata bedanken voor nuttig advies over planarian transplantatie en het verleden en huidige leden van de Sánchez lab voor waardevolle discussies tijdens de ontwikkeling van deze technieken. Dit werk werd ondersteund door NIH Training Grant (5T32 HD0791) om OCG en NIH R37GM057260 met ASA. ASA is een Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
Referências
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
