Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.
Epitel ve endotel hücreleri (EC) dış ve iç ortamdan dokusunun korunmasına paracellular bariyerler inşa ediyoruz. AK oluşan kan-beyin bariyeri (KBB), astrosit sonu ayaklar, perisitten ve bazal membran beyin parankimi korunması ve homeostazı sorumludur. Vitro BBB modellerinde BBB yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya ortak araçlardır Hücresel düzeyde. Vitro BBB modelleri farklı önemli bir kısmı bugüne kadar farklı laboratuarlarda araştırma için kurulmuştur. Genellikle, hücrelerin, inek, domuz, sıçan veya fare beyin dokusu (Wilhelm ve diğerleri tarafından gözden ayrıntılı olarak tartışılmıştır. 1) 'den elde edilmiştir. İnsan doku örnekleri laboratuarlarda veya şirketler 2,3 kısıtlı sayıda kullanılabilir. Primer hücre hazırlıklar zaman alıcıdır ve AK kültürlerin partiden partiye farklılık da, kurulması AK lin ölümsüzleştirdies bilimsel ilgi odağıdır.
Burada, yenidoğan fare beyin bir ölümsüzleştirdi beyin mikrovasküler AK hattı kurulması için bir yöntem mevcut. Biz reaktifler ve çözümler kullanılan prosedürü adım adım listesi açıklanmaktadır. Bizim laboratuvar tarafından kurulan yöntemi dört ila beş hafta içinde homojen ölümsüzleştirdi endotelyal hücre hattının izolasyonu sağlar. Beyin mikrovasküler endotel hücre hatları cEND 4 olarak adlandırılan (serebral korteks) ve 5 (serebellar korteks) cerebEND, Förster laboratuvarda bu prosedüre göre izole edildi ve etkili BBB farklı fizyolojik ve patolojik süreçlerin açıklanması için kullanılmıştır. CEND ve cerebEND kullanarak biz bu hücrelerin glukokortikoid 4,6-9 yanıt ve gibi TNF 5,8 gibi pro-infammatory mediatörlerin yanı östrojen tedavisi 10 olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz birden sc patoloji inceledikyi amaçladık 11 ve AT-düzeyde hipoksi 12,13. CEND ve cerebEND hatları lenfositler veya kanser hücreleri ile AK farklı uyaranlara veya etkileşim EC ve BBB, hücresel cevaplarının yapısı ve işlevi incelemek için iyi bir araç olarak kabul edilebilir.
Burada tarif edilen prosedür vasküler endotelyum fonksiyon olarak belirli değişiklikler incelemek için çeşitli fare suşlarının yanı sıra farklı knock-out fare suşları AK haplarına reçetesiz mikrovasküler izolasyonu için de kullanılabilir. Ölümsüzleşme için bir yöntem olarak, mürin polyomavirus, Polyoma orta T antijen onkoprotein ile dönüşüm kullanılır. Bu, in vivo ve in vitro 20,21,22 hızla olgunlaşmamış endotel hücreleri dönüştürür. Literatürde tanımlanan EC arasında ölümsüzleşme diğer yöntemler, örneğin SV40 büyük Simian Virüs Vacuolating T antijen 40 23, adenovirüs E1 gen ürün 24 ya da insan telomeraz 3'ün katalitik alt birimi aşırı ekspresyonu ile ölümsüzleşme içerir. PymT ile ölümsüzleşme kısa bir süre içinde neonatal fareden homojen bir AT kültürü elde olanak mürin olgunlaşmamış EC için spesifiktir. Ölümsüzleşme hücreleri ve inci özelliklerini değiştirirölümsüzleştirilmiş hücre hatları ile elde edilen sonuçlar e birincil hücreler ile birlikte ya da fareler, in vivo deneyler ile ya da karşılaştırılması gerekmektedir. PymT ölümsüzleştirdi AT ürokinaz tipi plazminojen aktivatörü artan üretiminden kaynaklanan fibrinolitik aktivite yüksek düzeyde ifade açıklanan ve plazminojen aktivatör inhibitörleri 25 üretimi azalmıştır. PymT Doğrudan karşılaştırma vitro BBB modellerinde hem de T hücre adezyonu çalışmalarında 26 için uygun olduğunu ortaya ilköğretim bEND5 hücre hattı, AK haplarına reçetesiz ölümsüzleştirdi.
Tarif edilen prosedüre göre tespit hücre hatları hücreler yaşlanma sırasında bu özellikleri kaybederse, bbb ve EC kavşak proteinlerin yüksek ekspresyonu ile bariyer özelliklerini korumak için düşük geçiş sayısını da kullanılabilir. Böylece bariyer özellikleri kaybından sonra, yeni bir hücre çizgisinin hazırlanması dikkate alınmalıdır. Hücre kaplama yoğunluğu bu hücre proliferasyonu için kritik olduğu gibi, EC için yüksek olmalıdır. Bu da ölümsüzleştirilmiş EC bakımı gibi izolasyon prosedürü sırasında dikkate alınmalıdır. Her yeni hücre hattı olan bariyer özellikleri ve diğer hücre türleri ile olası kirleticiler için test edilmelidir. AK monolayers oligodendrosit, astrositler ve perisitlere 4,27 ile kontaminasyon dışlamak için primer antikor olarak anti-galactocerebroside, anti-glial fibriler asidik protein ve anti-düz kas antijeni ile lekeli olabilir. Meningal damar tarafından kontaminasyona ekarte etmek için, trombomodülin ifadesi beynin 28 hariç tüm vasküler yataklarda ifade edildiği, test edilebilir.
İlginçtir, beynin farklı bölgelerinde izole ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hatları pro-inflamatuar uyaranlara kendi bariyer özellikleri ve duyarlılıkları farklıdır. Bir örnek olarak, beyin cEND ve serebellar cerebEND hücre çizgileri 4,5 söz edilebilir. CerebEND karşılaştırıldığında gösterdi, başlıca bileşenler sıkı birleşim Claudin-1 ve occludin daha düşük seviyelerde ifade cEND için. Bununla birlikte, Claudin-3 ve -12 seviyeleri cerebEND daha yüksek bulunmuştur. CerebEND hücrelerin bariyer fonksiyonunun cEND hücrelerinin bariyer özellikleri 5 mi daha TNFa iltihaplı aracı ile tedavi altında, çok daha fazla acı. Inflamatuar uyaranlara Yükseköğretim serebellar açığı, multipl skleroz hastalarında ve ensefalomiyelit 29 otoimmün onun hayvan modelinde deneysel in vivo olarak görülebilir. Bu ilginç bulgu beyin içine hedefleme gelecek ilaç geliştirilmesi için, üretim ve beynin farklı bölgelerinde için in vitro model içinde bireysel karakterize gerektiğini göstermektedir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma hibe sayısı FO 315/4-1 ve DFG SFB 688 altında Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |