Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em> In vitro</em> Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA
Summary
En teknik til at identificere translationelle pause-steder på mRNA, er beskrevet. Denne procedure er baseret på isolering af nascente polypeptider akkumuleres på ribosomer under in vitro-translation af et mål-mRNA, efterfulgt af størrelses-analyse af nascente kæder under anvendelse af en denaturerende gelelektroforese.
Abstract
Hastigheden af translationelle forlængelse er ikke ensartet. mRNA sekundær struktur, codonanvendelsen og mRNA associerede proteiner kan ændre ribosom bevægelse på meddelelsen for review se 1. Men er det nu bredt accepteret, at synonyme codonanvendelsen er den primære årsag til ikke-ensartede translationelle brudforlængelse vækst1. Synonyme kodoner ikke anvendes med samme frekvens. En forspænding findes i anvendelsen af synonyme kodoner med nogle codons, der anvendes oftere end andre 2. Kodon-bias er organisme, samt vævsspecifikke 2,3. Desuden frekvens kodonanvendelse er direkte proportional med koncentrationen af beslægtet tRNA'er 4. Således vil en hyppigt anvendt kodon har højere mængde af tilsvarende tRNA'er, som yderligere antyder, at en hyppig kodon vil blive omsat hurtigere end en sjælden én. Således vil regionerne på mRNA beriget i sjældne codons (potentielle pause-steder), som hovedregel bremse ribosom bevægelse på Message og forårsage akkumulering af nascente peptider fra de respektive størrelser 5-8. Disse pause-steder kan have funktionel effekt på proteinekspression, mRNA-stabilitet og proteinfoldning for en oversigt se 9. Faktisk blev det vist, at lettelse af sådanne pause-steder kan ændre ribosom bevægelse mRNA og efterfølgende kan påvirke effektiviteten af co-translationel (in vivo) proteinfoldning 1,7,10,11. At forstå processen af proteinfoldning in vivo, i cellen, der i sidste ende koblet til processen af proteinsyntese er det vigtigt at opnå omfattende indsigt i virkningen af kodonanvendelse / tRNA indhold på bevægelsen af ribosomer langs mRNA under translationel brudforlængelse .
Her beskriver vi en enkel teknik, der kan anvendes til at lokalisere større oversættelse pause-steder for et givet mRNA translateres i forskellige cellefrie systemer 6-8. Denne procedure er baseret på isolering af spirende polypeptider accumulating på ribosomer under de vitro-translation af et mål-mRNA. Rationalet er, at lavfrekvente kodoner, stigningen i opholdstiden af ribosomerne resulterer i forøgede mængder af nascente peptider til de tilsvarende størrelser. In vitro-transkriberet mRNA anvendes til in vitro translationelle reaktioner i nærvær af radioaktivt mærkede aminosyrer at tillade påvisning af spirende kæder. For at isolere ribosom bundne nascente polypeptidkomplekser oversættelsen reaktionen lag oven på 30% glycerol-opløsning efterfulgt af centrifugering. Spirende polypeptider i polysomalt pellet behandles yderligere med ribonuclease A og adskilt ved SDS PAGE. Denne teknik kan potentielt anvendes til hvilket som helst protein og tillader analyse af ribosomet bevægelse langs mRNA og påvisning af de store pause-steder. Derudover kan denne protokol tilpasses til at studere faktorer og forhold, der kan ændre ribosom bevægelse og dermed potentielt kan også ændre the funktion / konformation af proteinet.
Protocol
Discussion
For reproducerbare resultater, og koncentration af de komponenter, der anvendes til in vitro-transkriptions-og translationsreaktioner er kritiske. I den aktuelle undersøgelse har vi anvendt kommercielt tilgængelige kits og ekstrakter, der tilvejebringer meget reproducerbare data, hvis den håndteres forsigtigt. Imidlertid kan translation-kompetente ekstrakter kan fremstilles ud fra cellen af et valg, hvis det er nødvendigt. Kvaliteten af mRNA kan påvirke translation, så er det af yderste vigtighed fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Human Frontier Science Program tilskud RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
Referências
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
