Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em> In vitro</em> Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren
Summary
Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.
Abstract
De snelheid van translationeel rek is niet uniform. mRNA secundaire structuur, codongebruik en mRNA bijbehorende eiwitten kunnen ribosoom beweging te wijzigen op het bericht voor review zie 1. Echter, het is nu algemeen aanvaard dat synoniem codon-gebruik is de belangrijkste oorzaak van niet-uniforme translationeel rek tarieven 1. Synoniem codons worden niet gebruikt met dezelfde frequentie. Een voorkeur bestaat in het gebruik van synoniem codons enkele codons vaker gebruikt dan andere twee. Codon bias is organisme en weefsel-specifieke 2,3. Bovendien frequentie codongebruik is recht evenredig met de concentratie van verwante tRNA 4. Zo zal een veel gebruikte codon hogere massa overeenkomstige tRNA, die verder betekent dat vaak codon harder dan een zeldzame een vertaald. Zo zal de regio's op mRNA verrijkt met zeldzame codons (potentiële pauze sites) te vertragen in de regel naar beneden ribosoom beweging op de Message en de oorzaak accumulatie van ontluikende peptiden van de respectievelijke maten 5-8. Deze pauze sites kunnen functionele impact hebben op de eiwitexpressie hebben, mRNA stabiliteit en het vouwen van eiwitten voor review zie 9. Er werd aangetoond dat het verlichten van deze pauze sites ribosoom beweging te wijzigen op mRNA en vervolgens kan de efficiëntie van co-translationele (in vivo) eiwitvouwing 1,7,10,11 beïnvloeden. Om het proces van eiwitvouwing in vivo begrijpen in de cel, die uiteindelijk is gekoppeld met de werkwijze van de eiwitsynthese is het noodzakelijk volledig inzicht in het effect van codongebruik / tRNA inhoud van de beweging van ribosomen langs mRNA tijdens translatie elongatie .
Beschrijven we een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om grote vertaling onderbreken plaatsen voor een bepaalde mRNA vertaald in verschillende celvrije systemen 6-8 vinden. Deze procedure is gebaseerd op de isolatie van ontluikende Polypeptiden accumulating van ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA. De reden is dat bij lage frequenties codons, de toename van de verblijftijd van de ribosomen resultaten in grotere hoeveelheden beginnende peptiden van de overeenkomstige afmetingen. In vitro getranscribeerde mRNA gebruikt voor in vitro translatie reacties in aanwezigheid van radioactief gemerkt aminozuren de detectie van de beginnende ketens mogelijk. Om ribosoom gebonden beginnende polypeptide complexen isoleren vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing gevolgd door centrifugatie. Nascent Polypeptiden in polysomal pellet verder behandeld wordt met ribonuclease A en opgelost door SDS-PAGE. Deze techniek kan eventueel worden gebruikt voor een eiwit en laat analyse van ribosoom beweging langs mRNA en de detectie van de grote pauze sites. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan factoren en omstandigheden die ribosoom beweging kan dus veranderen en mogelijk kan ook veranderen e bestuderene functie / conformatie van het eiwit.
Protocol
Discussion
Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie reacties kritisch zijn. In de huidige studie hebben we gebruik hebben gemaakt van commercieel verkrijgbare kits en extracten die zeer reproduceerbare gegevens te verstrekken, indien zorgvuldig behandeld. Echter, vertaling-competent extracten worden bereid uit de cel van een keuze, indien nodig. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de inte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
Referências
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
