Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em> In vitro</em> För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA
Summary
En teknik för att identifiera translationella pausa platser på mRNA beskrivs. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider som samlas på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA, följt av storleksanalys av begynnande kedjorna med användning av en denaturerande gel-elektrofores.
Abstract
Hastigheten för translationella töjning är olikformig. mRNA sekundär struktur, kodon användning och mRNA associerade proteiner kan förändra ribosomen rörelse på meddelandet för översikt se 1. Men det är nu allmänt accepterat att synonymt kodon användning är den främsta orsaken till icke-enhetliga translationella förlängning priser 1. Synonyma kodon används inte med samma frekvens. En förspänning existerar i användningen av synonyma kodon med vissa kodoner som används mer frekvent än andra 2. Kodon fördomar är organism, liksom vävnadsspecifik 2,3. Dessutom är frekvensen av kodonanvändning direkt proportionell mot koncentrationen av kognat-tRNA-sekvenser 4. Således kommer en ofta använd kodon har högre mängd motsvarande tRNA, vilket ytterligare innebär att en frekvent kodon kommer att översättas snabbare än en sällan en. Således kommer regionerna på mRNA anrikas i sällsynta kodon (potentiella paus platser) som regel långsammare ribosomen rörelse på messaGE och orsaka ackumulering av halvfärdiga peptiderna för de respektive storlekarna 5-8. Dessa paus webbplatser kan ha funktionell påverkan på protein expression, mRNA stabilitet och protein folding för översikt se 9. I själva verket visade det sig att lindra dessa paus webbplatser kan förändra ribosomen rörelse på mRNA och därefter kan påverka effektiviteten av sam-translationell (in vivo) proteinveckning 1,7,10,11. För att förstå processen för proteinveckning in vivo, i cellen, som slutligen är kopplad till processen att proteinsyntesen är det viktigt att få omfattande insikt i effekterna av kodonanvändningen / tRNA innehåll på den fria rörligheten för ribosomer längs mRNA under translationell förlängning .
Här beskriver vi en enkel teknik som kan användas för att lokalisera viktiga platser översättning paus för en viss mRNA översätts i olika cellfria system 6-8. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA. Den logiska grunden är att vid låga frekvenser kodoner, ökningen i uppehållstiden för ribosomer resulterar i ökade mängder av halvfärdiga peptiderna av de motsvarande storlek. In vitro transkriberade mRNA används för in vitro translationella reaktioner i närvaro av radioaktivt märkta aminosyror för att tillåta detektering av de begynnande kedjorna. För att isolera ribosom bundna begynnande polypep-komplex i translationsreaktionen skiktas på toppen av 30% glycerol-lösning följt av centrifugering. Begynnande polypeptider i Polysomalt pellet ska fortsätta behandlas med ribonukleas A och lösas genom SDS-PAGE. Denna teknik kan potentiellt användas för något protein och medger analys av ribosomen rörelse längs mRNA och detektering av de stora paus ställen. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att studera faktorer och förhållanden som kan förändra ribosomen rörelse och därmed potentiellt kan också förändra the funktion / konformation av proteinet.
Protocol
Discussion
För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkriptions-och translationsreaktioner är kritiska. I den aktuella studien har vi använt kommersiellt tillgängliga kit och extrakt som ger mycket reproducerbara data, om den hanteras varsamt. Emellertid kan översättning-kompetenta extrakt framställas från cellen av en val, om så behövs. Kvalitet av mRNA kan påverka translation, så är det av yttersta vikt för att testa integriteten hos mRNA inn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
Referências
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
