リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールとしてSECM逮捕シーケンスを使用して、
Summary
ここでは今定期的に安定的に結合したリボソーム新生鎖複合体（のRNC）を分離するために使用される手法について説明します。この手法は、17アミノ酸長いSECM "逮捕シーケンスは"原核生物の翻訳伸長を停止することができるという発見を利用しています（<em> E.大腸菌</em>実質的に任意のタンパク質（またはC末端に融合させた）に挿入された）システムでは、。
Abstract
広範な研究は、細胞内のタンパク質のフォールディングの共同翻訳プロセス1から5であることを示唆している十分な証拠を提供しています。しかし、その機能的なフォームを実現するための共同翻訳折りたたみ時のポリペプチド鎖が続くことを正確な経路はまだ謎です。このプロセスを理解し、共同翻訳の折り畳み中間体の正確な立体構造を決定するために、それは彼らのさらなる構造解析を可能にするために所定のサイズの新生鎖を保有するRNCの分離を可能にする技術を開発することが不可欠です。
SECM（分泌モニター）は、170アミノ酸E.です。 SECM-セカオペロン6の下流セカ（分泌駆動）ATPaseの発現を調節する大腸菌の蛋白質。 Nakatogawaと伊藤は当初、SECMタンパク質のC末端領域17アミノ酸長いシーケンス（150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166）への十分かつ必要であることがわかったこれにより、安定したリボソームのP部位7-9結合したペプチジル-グリシル-tRNAを生成する、Gly165でSECM伸びの停滞が発生します。さらに重要なのは、それはこの17アミノ酸長いシーケンスは、このように所定の大きさ7の新生鎖を保有するRNCの生産を可能にする事実上すべてのフルレングスおよび/ または切り捨てられたタンパク質のC末端に融合させることができることがわかった。したがって、標的タンパク質に融合または挿入したときに、SECMストールシーケンスは、ポリペプチド鎖の伸長の逮捕を生成し、E.の in vivo の両方で安定したRNCを生成する大腸菌細胞と無細胞系の in vitro インチショ糖密度勾配遠心法は、さらにRNCを分離するために利用されています。
孤立したRNCは、共同翻訳の折り畳み中間体の構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。最近、この手法は成功した10,11、いくつかのリボソーム結合した新生鎖の構造への洞察を得るために使用されている。ここでは、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離SECMに融合し 、in vitro 翻訳系で生成について説明します。
Protocol
Discussion
再現可能な結果を得るためには、in vitro転写と翻訳のために使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。慎重に処理した場合、我々は、in vitro転写と翻訳の抽出物で市販されている使用していると、彼らは効率的かつ再現可能な結果を与える。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないので、in vitro翻訳のためにそれを使用する前に、mRNAの整?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム助成RGP0024によって資金を供給された。
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
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