باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم
Summary
نحن هنا وصف الاسلوب الذي يستخدم الآن بشكل روتيني لعزل متجهة ستابلي الريبوسوم المجمعات سلسلة الوليدة (RNCs). هذه التقنية يستفيد من اكتشاف ان 17 حمض أميني طويل "تسلسل اعتقال" SecM يمكن وقف استطالة ترجمة في بروكاريوتيك (<em> E. كولاي</em>) النظام، وعندما أدرجت في (أو تنصهر في النهاية-C) من بروتين أي عمليا.
Abstract
وقد وفرت بحوث مستفيضة أدلة وافرة تشير إلى أن بروتين قابلة للطي في الخلية هو عملية مشتركة متعدية 1-5. ومع ذلك، فإن المسار الدقيق الذي يلي سلسلة ببتيد خلال التعاون متعدية للطي لتحقيق شكلها وظيفي لا يزال لغزا. من أجل فهم هذه العملية وتحديد التشكل الدقيق للوسيطة مشتركة متعدية للطي، وأنه من الضروري لتطوير التقنيات التي تسمح للعزلة RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا للسماح للمزيد من تحليل الهيكلية.
SecM (راصد إفراز) هو 170 E. حامض اميني بروتين كولاي التي تنظم التعبير عن أتباز المصب (القيادة إفراز) سيكا في الاوبرون secM سيكا-6. Nakatogawa وايتو وجدت في الأصل أن 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) في منطقة C-محطة من البروتين SecM غير كاف وضروري لتسبب توقف استطالة SecM في Gly165، وبذلك تنتج ببتيديل-غليسيل-الحمض الريبي النووي النقال ملزمة ثابت إلى الريباسي ف موقع 7-9. الأهم من ذلك، فقد وجد أن هذا يمكن أن تنصهر فيها 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة للوصول إلى محطة-C من بروتين أي تقريبا كامل طول و / أو مبتورة وبالتالي السماح لإنتاج RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا 7. وبالتالي، عندما تنصهر أو إدراجها في بروتين الهدف، SecM تسلسل مماطلة تنتج القبض على استطالة سلسلة ببتيد ويولد RNCs مستقرة على حد سواء في الجسم الحي في E. خلايا القولونية و. في المختبر في نظام خالية من الخلايا ويستخدم مزيد من السكروز الطرد المركزي المتدرج لعزل RNCs.
يمكن استخدام RNCs معزولة لتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية في وسيطة مشتركة متعدية للطي. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بنجاح هذه التقنية للحصول على نظرة ثاقبة لبناء سلاسل عدة متجهة الريبوسوم الوليدة 10،11. نحن هنا وصف عزلة غلوبولين العدسة غاما-B البقري RNCs تنصهر إلى SecM ولدت في الترجمة في نظام المختبر.
Protocol
Discussion
من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ والترجمة المختبر حاسمة. وقد استخدمنا المتاحة تجاريا في المختبر، ونسخ مقتطفات الترجمة وأنها تعطي نتائج فعالة وقابلة للتكرار، إذا ما تم تناوله بعناية. نوعية مرنا يمكن أن تؤثر على …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
Referências
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 .
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
