Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo
Summary
Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.
Abstract
Os neutrófilos são o tipo mais abundante de células brancas do sangue. Eles formam uma parte essencial do sistema imune inato 1. Durante a inflamação aguda, os neutrófilos são as primeiras células inflamatórias para migrar para o local da lesão. Recrutamento dos neutrófilos para um local da lesão é um processo gradual que inclui a dilatação, primeiro de vasos sanguíneos para aumentar o fluxo sanguíneo; segundo, microvasculares alterações estruturais e escapar de proteínas do plasma a partir da corrente sanguínea, o terceiro, aderência, laminagem e transmigração de neutrófilos através do endotélio; e quarta acumulação de neutrófilos no local da lesão 2,3. Uma vasta gama de in vivo e de vitro evoluiu para permitir o estudo destas 4 processos. Este método enfoca a transmigração de neutrófilos através de células endoteliais humanas.
Um método popular para examinar os processos moleculares envolvidos na transmigração de neutrófilos utiliza n humanoeutrophils interagindo com primários células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) 5. Isolamento dos neutrófilos tem sido descrito em outro lugar visualmente 6; assim, este artigo vai mostrar o método para o isolamento de HUVEC. Uma vez isolado e crescidas até à confluência, as células endoteliais são activados resultando na regulação positiva de moléculas de adesão e de activação. Por exemplo, a activação das células endoteliais com citoquinas como TNF-a resulta em aumento E-selectina e IL-8 expressão 7. E-selectina medeia de captura e de rolamento de neutrófilos e IL-8 de activação e medeia a adesão firme dos neutrófilos. Depois de neutrófilos adesão transmigrar. Transmigração pode ocorrer paracellularly (através de junções de células endoteliais) ou transcellularly (através da célula endotelial em si). Na maioria dos casos, estas interacções ocorrer sob condições de fluxo encontrados na vasculatura 7,8.
A câmara de fluxo de placas paralelas é um sistema muito usado que mimicrofones o cisalhamento hidrodinâmico tensões encontrado in vivo e permite o estudo do recrutamento dos neutrófilos sob condição de fluxo in vitro 9,10. Várias empresas produzem câmaras de fluxo de placas paralelas e cada um tem vantagens e desvantagens. Se fluorescente de imagem é necessário, de vidro ou um polímero opticamente semelhante precisa de ser utilizado. As células endoteliais não crescem bem em vidro.
Apresentamos aqui um método fácil e rápido para a imagiologia de contraste de fase, DIC e fluorescentes de transmigração de neutrófilos utilizando um baixo volume de corrediça canal ibidi feito de um polímero que suporta a adesão rápida e crescimento de células endoteliais humanas e tem qualidades ópticas que são comparáveis aos vidro. Neste método, as células endoteliais foram cultivadas e estimuladas em um μslide ibidi. Os neutrófilos foram introduzidos sob condições de escoamento e transmigração foi avaliada. Imagem fluorescente das junções activado em tempo real determinação da extensão de paracelular contratransmigração transcelular.
Protocol
Discussion
Os pesquisadores têm utilizado rotineiramente células endoteliais de diversos leitos vasculares para estudar o recrutamento de neutrófilos e transmigração. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, células endoteliais microvasculares dérmicas 12, fígado sinusoidais células endoteliais 13 e células endoteliais da veia umbilical humana 10. Entre eles HUVEC ganharam popularidade devido à sua largura relativa facilidade de isolamento e de disponibilidade. HUVEC são …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Pina Colarusso eo Mecanismo de imagens de células vivas para sua colaboração com a imagem e análise de imagem; Ms. Lailey por sua assistência técnica; e unidade 51 no Hospital Foothills, em Calgary, AB pela prestação de cordões umbilicais humanos. Dr. KD Patel é um Inova Alberta: Saúde Scientist Solutions. Este trabalho foi financiado por uma subvenção de funcionamento do Canadian Institutes for Health Research e doações de equipamentos e infra-estrutura da Fundação Canadense para Inovação e da Ciência e da Autoridade de Alberta Research.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
Referências
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