흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리
Summary
이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.
Abstract
Neutrophils는 백혈구 중 가장 풍부한 타입입니다. 그들은 타고난 면역 시스템 1의 필수적인 부분을 형성합니다. 급성 염증 동안, neutrophils는 부상의 사이트로 마이 그 레이션하는 최초의 염증 세포가 있습니다. 전체 호중구의 세 번째 압연, 접착력과 윤회이고 두 번째는 microvascular 구조적 변화와 혈류에서 혈장 단백질 탈출, 부상 사이트에 neutrophils의 채용은 혈액 흐름을 증가 혈관이 먼저 팽창을 포함 stepwise 과정입니다 내피, 부상 2,3의 사이트에 neutrophils의 및 네 번째 축적. 생체내 및 시험 관내 방법의 다양한는 이러한 프로세스 4의 연구를 활성화하는 진화하고있다. 이 방법은 인간의 내피 세포에 걸쳐 호중구 윤회에 초점을 맞추고 있습니다.
호중구 윤회에 관련된 분자 프로세스를 검사 하나는 인기있는 방법은 인간의 N을 활용기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 5 상호 작용 eutrophils. 호중구 격리는 다른 여섯 시각적으로 설명하고, 따라서이 문서는 HUVEC의 격리를 위해 방법을 보여줍니다. 일단 격리와 합류로 성장, 내피 세포 부착 및 활성화 분자의 upregulation 결과적으로 활성화됩니다. 예를 들어, 증가 E-selectin 및 IL-8 표현 7의 TNF-α 결과 같은 크린 시토킨와 내피 세포의 활성화. E-selectin의 mediates neutrophils과 IL-8 mediates 활성화와 neutrophils의 확고한 유착의 캡처 및 압연. 유착 neutrophils은 윤회하다 후에. 윤회가 (내피 세포 자체를 통해) transcellularly paracellularly 발생 (내피 세포 분기점을 통해) 또는 수 있습니다. 대부분의 경우 이러한 상호 작용은 vasculature 7,8에서 발견 유동 조건에서 발생합니다.
병렬 플레이트 흐름 챔버는 널리 사용되는 시스템입니다 MI유체 전단은 생체내에서 발견하고 체외 9,10에서 유동 조건하에 호중구 채용의 학습을 가능하게합니다. 강조 마이크 몇몇 기업들은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 생성하고 각각 장점과 단점이 있습니다. 형광 이미징이 필요한 경우, 유리 또는 광학 유사한 폴리머가 사용해야합니다. 내피 세포는 유리에 잘 성장하지 않습니다.
여기 급속한 접착력과 인간 내피 세포의 성장을 지원하며 비교할 수있는 광학 자질이 있는지 폴리머로 만들어진 낮은 볼륨 ibidi 채널 슬라이드를 사용하여 호중구 윤회의 위상 대비, DIC 및 형광 이미징을위한 쉽고 빠른 방법을 제시 유리. 이 방법에서는 내피 세포 성장되었으며 ibidi의 μslide에 자극. Neutrophils는 유동 조건에서 소개되었으며 윤회가 평가되었다. 분기점의 형광 이미징은 대 paracellular의 범위에 실시간 결정을 활성화transcellular 윤회.
Protocol
Discussion
연구자는 정기적으로 호중구 모집하고 윤회를 공부하기 위해 다른 혈관 침대에서 내피 세포를 사용 하였다. 예는 있지만, 피부 microvascular 내피 세포 12, 인간 제대 정맥에서 10 간 sinusoidal 내피 세포를 13 내피 세포에 제한되지 않습니다. 그들 중에는 HUVEC 때문에 고립과 가용성 그들의 상대적 용이성의 넓은 인기를 얻었다. HUVEC은 생체내에서 발생하는 많은 내피 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그녀의 기술 지원 양 Lailey;과 인간의 탯줄 코드를 제공하는 캘거리, AB의 산기슭 병원의 단위 51 우리는 박사 피나 Colarusso 및 이미징 및 이미지 분석과 그들의 도움을 라이브 셀 이미징 시설 감사드립니다. 박사 KD 파텔은 앨버타 혁신이다 : 건강 솔루션 과학. 이 작품은 혁신과 앨버타 과학 연구 기관에 대한 캐나다 재단 보건 연구 장비 및 인프라 조성을위한 캐나다 연구소에서 운영 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
Referências
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
