Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold
Summary
Denne artikkelen beskriver først en prosedyre for å isolere humane endotelceller fra navle årer og deretter viser hvordan å bruke disse cellene til å undersøke nøytrofile sjelevandring henhold strømningsforhold. Ved å bruke en lav-volum flyt kammer laget av en polymer med de optiske egenskapene til glass, er live-celle fluorescerende avbildning av sjeldne celle populasjoner også mulig.
Abstract
Nøytrofile er de mest tallrike type hvite blodlegemer. De danner en viktig del av det medfødte immunsystemet en. Under akutt betennelse, nøytrofile er de første betennelsesceller å migrere til området av skaden. Rekruttering av nøytrofile til en skade området er en trinnvis prosess som inkluderer første, utvidelse av blodkar for å øke blodgjennomstrømningen, andre, mikrovaskulære strukturelle endringer og rømme av plasmaproteiner fra blodet, for det tredje, rullende, heft og sjelevandring av nøytrofile over endotel, og fjerde akkumulering av nøytrofile på stedet av skader 2,3. Et bredt spekter av in vivo og de vitro metoder har utviklet seg slik at studiet av disse prosessene 4. Denne metoden fokuserer på nøytrofile sjelevandring tvers humane endotelceller.
En populær metode for å undersøke de molekylære prosessene som er involvert i nøytrofile sjelevandring benytter menneskelige neutrophils samspill med primære humane umbilical vein endotelceller (HUVEC) 5. Nøytrofile isolasjon har blitt beskrevet visuelt sted 6, derfor denne artikkelen vil vise metode for isolering av HUVEC. Når isolert og vokst til samløpet, er endotelceller aktivert resulterer i oppregulering av adhesjon og aktivering molekyler. For eksempel, aktivering av endotelceller med cytokiner som TNF-alfa resulterer i økt E-selektin og IL-8 uttrykk 7. E-selektin medierer fangst og rulling av nøytrofile granulocytter og IL-8 medierer aktivisering og fast vedheft av nøytrofile. Etter vedheft nøytrofile transmigrate. Sjelevandring kan forekomme paracellularly (gjennom endotelcelle veikryss) eller transcellularly (via endotelceller selv). I de fleste tilfeller er disse interaksjonene oppstår under strømningsforhold funnet i blodkar 7,8.
Parallellen plate flyt kammer er et mye brukt system som mimikrofoner den hydrodynamiske skjærspenninger funnet in vivo og muliggjør studiet av nøytrofile rekruttering henhold gjennomstrømning in vitro 9,10. Flere selskaper produserer parallelle plate flyt kamre og hver har sine fordeler og ulemper. Hvis fluorescerende bildebehandling er nødvendig, må glass eller en optisk lignende polymer som skal brukes. Endotelceller ikke vokse bra på glass.
Her presenterer vi en enkel og rask metode for fase-kontrast, DIC og fluorescerende avbildning av nøytrofile sjelevandring med et lavt volum ibidi kanal lysbilde laget av en polymer som støtter den raske heft og vekst av humane endotelceller og har optiske kvaliteter som er sammenlignbare med glass. I denne metoden, ble endotelceller vokst og stimulert i en ibidi μslide. Nøytrofile ble introdusert under strømningsforhold og sjelevandring ble vurdert. Fluoriserende avbildning av avkjøringene aktivert sanntid fastsettelse av omfanget av paracellular versustranscellular sjelevandring.
Protocol
Discussion
Forskere har rutinemessig brukt endotelceller fra ulike vaskulære senger å studere nøytrofile rekruttering og sjelevandring. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, dermale mikrovaskulære endotelceller 12, lever sinusformet endotelceller 13 og endotelceller fra menneskelig umbilical vein 10. Blant dem HUVEC oppnådd stor popularitet på grunn av sin relativt enkelt av isolasjon og tilgjengelighet. HUVEC er en mektig in vitro modell system som etterligner mange e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Pina Colarusso og Live Cell Imaging Facility for deres assistanse med bildebehandling og bildeanalyse, Ms Lailey for henne teknisk assistanse, og enhet 51 ved foten Hospital i Calgary, AB for å gi menneskelige navle snorer. Dr. KD Patel er en Alberta innovates: Health Solutions Scientist. Dette arbeidet ble støttet av en driftsstøtte fra det kanadiske Institutes for Health Research og utstyr og infrastruktur tilskudd fra det kanadiske Foundation for innovasjon og Alberta vitenskap og forskning Authority.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
Referências
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
