एक अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण Biofilm संरचना का उपयोग झुर्रियों कालोनी विकास का आकलन

Summary

हम एक सरल, अर्द्ध मात्रात्मक biofilm गठन की जांच के लिए विधि प्रदान करते हैं<em> इन विट्रो में</em>. इस विधि Zeiss STEMI का लाभ लेता है 2000 सी माइक्रोस्कोप विदारक कैमरा लगाव के साथ दोनों समय और biofilm गठन के पैटर्न पर नजर रखने के लिए, के रूप में झुर्रियों कालोनियों के विकास के द्वारा मूल्यांकन किया है.

Abstract

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses ¹. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities ². In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media ³. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis ⁴, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae ⁵, Vibrio parahaemolyticus ⁶, Pseudomonas aeruginosa ⁷, and Vibrio fischeri ⁸.

The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes ^8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect ^9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization ^8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.

In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This ‘spotted culture’ technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

Protocol

1. प्रारंभिक लक्षण वर्णन और विचार Biofilm गठन आम तौर पर सेल घनत्व और वृद्धि दर से प्रभावित है. इसलिए, यह विकास समय के साथ ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) में वृद्धि की दर और ब्याज के तनाव (ओं) की सरल वृद्धि वक्र और सेल चढ़ाना assays के प्रदर्शन से उपज (अंतिम सेल नंबर) निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. विकास, या आयुध डिपो और सेल संख्या के बीच सहसंबंध के अभाव में दोष ध्यान में रखा जाना चाहिए जब खोलना प्रयोगों से परिणाम की व्याख्या. एक ही थाली पर उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण में शामिल हैं जब झुर्रियों कॉलोनी गठन का आकलन है, के रूप में मामूली भिन्नता प्लेट से प्लेट biofilm विकास प्रभाव हो सकता है. खोलना के लिए सबसे अच्छी स्थिति, यानी, उन है कि नियंत्रण और हित के उत्परिवर्ती (ओं) के बीच सबसे स्पष्ट मतभेद प्रकट पहचानें. विभिन्न स्थितियों, जैसे विभिन्न मीडिया या तापमान के नीचे तरल संस्कृति में उपभेदों बढ़ती है, और अलग मंचविकास (घातीय या स्थिर चरण) के पहले खोलना है. स्पॉट संस्कृति के उपयुक्त मीडिया पर विभिन्न सेल घनत्व में 10 μl, सेते हैं और वांछित तापमान पर तक कॉलोनी morphologies स्पष्ट हो. परख अंत बिंदु खोलना (यानी, 48 घंटे) के बाद झुर्रियों कॉलोनी गठन के एक पूर्व निर्धारित समय बिंदु पर मूल्यांकन शामिल है. यह आकलन उपभेदों के लिए उपयोगी है कि एक्ज़िबिट (या प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं) biofilm गठन में गंभीर दोष है. समय बेशक परख समय की अवधि (यानी, हर घंटे) के बाद खोलना पर झुर्रियों कॉलोनी गठन का आकलन है. इस परख अनुमति झुर्रियों कॉलोनी गठन पैटर्न और समय की अवधि से अधिक विकास की शुरुआत के निर्धारण से biofilm गठन की एक अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन परमिट. प्रारंभिक प्रयोगों में प्रयोग और एक निश्चित समय के पाठ्यक्रम के लिए संग्रह अंक की संख्या की अवधि निर्धारित की जानी चाहिए. आसानी से समय के बाद खोलना ट्रैक पर रखने के लिए,IMER तक गिनती. 2. वी. में झुर्रियों कालोनी आकृति विज्ञान की सूक्ष्म मूल्यांकन fischeri टीका लगाना वी. लेग नमक (एलबीएस) 13 मध्यम (1% [w / वी] tryptone, 0.5% [w / वी] खमीर निकालने, 2% [w / वी] सोडियम क्लोराइड, 50 मिमी Tris – एचसीएल [5 मिलीलीटर में fischeri कोशिकाओं 7.5 पीएच]) मिलाते, 28 रातोंरात के साथ किसी भी आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं और सेते हैं, युक्त डिग्री सेल्सियस सुबह में, ताजा एलबीएस और एक ही परिस्थितियों में मध्यम सेते हैं की 5 मिलीलीटर में एक 1:100 कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं subculture तक कोशिकाओं वांछित 600 आयुध डिपो तक पहुँच चुके हैं (उदाहरण के लिए, 600 आयुध डिपो = 0.2 या 0.5). विंदुक एक microfuge ट्यूब और एक मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक microfuge सेट में अपकेंद्रित्र में संस्कृति की मिलीलीटर 1. आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें. कोशिकाओं को धोने के लिए बाँझ 70% कृत्रिम समुद्री जल के 1 मिलीग्राम (ASW) (35 मिमी MgSO 4 7 2 हे, 7 मिमी CaCl में गोली resuspending अवशिष्ट मीडिया और बाह्य घटकों को दूर2-2H 2 हे, 210 मिमी NaCl, मिमी KCl +७) और centrifugation दोहरा. 70% ASW के 1 मिलीग्राम में धोया गोली Resuspend. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना कक्षों की एक ही नंबर के रूप में 600 एनएम के आयुध डिपो से अनुमान लगाया है. अतिरिक्त 70% ASW साथ और अधिक ध्यान केंद्रित नमूने कमजोर द्वारा किसी भी आवश्यक समायोजन करें. प्रारंभिक प्रयोगों में, विभिन्न मूल्यों प्रारंभिक आयुध डिपो में स्थान संस्कृतियों उपभेदों या शर्तों का एक सेट के लिए एक इष्टतम शुरू आयुध डिपो निर्धारित करने के लिए. वी. के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं fischeri जब स्पॉट लगभग 0.2 के एक आयुध डिपो के साथ संस्कृतियों से उत्पन्न कर रहे हैं. एलबीएस किसी भी आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटों पर धोया कोशिकाओं के 10 μl स्पॉट. जब एक थाली पर एक संस्कृति खोलना, अगर सतह से ऊपर स्थिर विंदुक अपनी उंगली से सुनिश्चित कर लें. खड़ी स्पॉट, एक कोण पर नहीं, तरल और स्थान के समान वितरण के लिए धीरे से बेदखल करना है. आम तौर पर प्रत्येक तनाव प्लेट प्रति एक बार देखा है (6 प्लेट प्रति स्पॉट) बुद्धि,प्रति घंटे प्रयोग कई प्लेट (2-3). यह सुनिश्चित करने के लिए कि देखा संस्कृति समान रूप से वितरित रहता है, स्थान इनक्यूबेटर में थाली जाने से पहले शुष्क करने की अनुमति. प्लेटों को पलटना और उन्हें 28 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस टीका के बाद 12-15 घंटे में बढ़ रही है हाजिर प्रति घंटा की शुरुआत की आकारिकी मॉनिटर. हम एक कैमरा लगाव (Progres C10 के प्लस) और Progres CapturePro और ImageJ सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों के निरीक्षण करने और कॉलोनी आकारिकी दस्तावेज़ और और झुर्रियों कॉलोनी गठन की शुरुआत प्रगति का आकलन करने के साथ एक विदारक गुंजाइश (Zeiss STEMI 2000-C) का उपयोग करें. विशिष्ट 2.5 कदम में सूचीबद्ध सेटअप के लिए स्पॉट के नीचे से एक सीएल 1500 चुनाव आयोग ठंड प्रकाश स्रोत के साथ एक पारदर्शी कांच चरण के माध्यम से प्रकाशित कर रहे हैं, जबकि ऊपर से छवियों पर कब्जा कर रहे हैं. इस सेटअप इमेजिंग झुर्रियों कॉलोनी विकास के लिए क्योंकि वी. इष्टतम है fischeri कालोनियों (स्पॉट) पारभासी हैं. विशिष्ट सेंट में सूचीबद्ध उपकरण के अभाव में2.5 EP, मॉनिटर झुर्रियों कॉलोनी आकारिकी किसी भी विदारक माइक्रोस्कोप है कि पूरी कॉलोनी को देखने के लिए अनुमति देता है और एक समायोज्य प्रकाश स्रोत और आदर्श, एक संलग्न कैमरा का उपयोग. यदि आवश्यक हो, एक डिजिटल कैमरा भी एक संलग्न कैमरा के अभाव में उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह इष्टतम नहीं है. सबसे अच्छा झुर्रियों कॉलोनी विकास कल्पना, यह आवश्यक है ऐसी है कि विकासशील biofilms के तीन आयामी आकारिकी discerned किया जा सकता है बैक्टीरियल कालोनियों के नीचे दोनों प्रकाश और प्रतिबिंब की तीव्रता कोण समायोजित. इष्टतम प्रकाश व्यवस्था की स्थिति कि देखा कॉलोनी और आसपास के पृष्ठभूमि, अगर ऐसा है कि कॉलोनी की वास्तुकला (झुर्रियाँ) स्पष्ट रूप से अलग पहचाना है के बीच मजबूत विपरीत प्रदान निर्धारण करते हैं. कुछ मामलों में, देखा कॉलोनी का रंग भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, के रूप में कॉलोनी के रंग में परिवर्तन biofilm गठन के दौरान हो सकता है. तीव्रता और प्रकाश स्रोत के कोण से पता चलता है समायोजित करेंरंगाई में इन सूक्ष्म परिवर्तन. एक बार उपयुक्त सेटिंग्स प्राप्त कर रहे हैं, उन्हें प्रयोग की अवधि के लिए बनाए रखने के. कितना समय बीतता टीका के समय से जो समय पर झुर्रियों कॉलोनी गठन प्रत्येक तनाव या हालत के लिए शुरू नोट. समय बिंदु है जिस पर patterning और 3 डी संरचनाओं के गठन (यानी, striations बाहरी छोर पर बनाने या 'लहर' के केंद्र में होने वाली) पहली बार स्पष्ट है झुर्रियों कॉलोनी गठन के शुरू के रूप में परिभाषित करें. उत्परिवर्ती कोशिकाओं या कम प्रदर्शन कर सकते हैं वृद्धि हुई झुर्रियों कॉलोनी गठन की शुरुआत (उदाहरण के लिए, चित्र 2) के लिए समय है. दस्तावेज़ उपयुक्त डिजिटल छवियों पर कब्जा करने और झुर्रियों कॉलोनी गठन की शुरुआत और विकास. यह एक ही बढ़ाई उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है जब प्रयोग भर छवियों का संग्रह है. माइक्रोस्कोप के ऐपिस से कंप्यूटर स्क्रीन कैमरे के पीछे पर स्थित लीवर का उपयोग करने के लिए दृश्य पर स्विच करें. जब ऐपिस के बीच स्विचनऔर कंप्यूटर स्क्रीन देखने, देखने और तदनुसार समायोजित ध्यान केंद्रित. इमेजिंग देखा संस्कृतियों से पहले, पेट्री प्लेट का ढक्कन आम तौर पर स्पष्ट छवि प्रदान करने के लिए हटा दिया है. बहरहाल, यह एक वैकल्पिक कदम है, के रूप में देखा संस्कृतियों ढक्कन 2.5 कदम और 2.6 में उल्लिखित स्थापना का उपयोग कर के माध्यम से imaged किया जा सकता है. झुर्रियों कॉलोनी गठन की शुरुआत के बाद हर बार बिंदु पर, झुर्रियों कॉलोनी विकास के पैटर्न ध्यान दें. वास्तुकला के अंदर बाहर से विकसित हो सकता है, या यह आकलन अंदर बाहर एक अलग उपभेदों से या अलग अलग परिस्थितियों में गठित biofilms भेद करने के लिए एक तंत्र प्रदान करता है. हर समय बिंदु पर कॉलोनी विकसित करने के व्यास उपाय. यह मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, या डिजिटल जुड़े एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर. अगर डिजिटल किया, Progres CapturePro सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करें और पहले विशिष्ट प्रयोग में प्रयोग किया जाता बढ़ाई पैमाने पर पट्टी जांचना. प्रत्येक पर कब्जा कर लिया छवि में पैमाने पर पट्टी शामिल हैं. कॉलोनी व्यास ImageJ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर की गणना करने के लिए, प्रत्येक छवि फ़ाइल को खोलने. पैमाने पर पट्टी के रूप में इस प्रकार का मानकीकरण: उपकरण पट्टी से "सीधे लाइन विकल्प" का चयन करें. एक ही लंबाई और चौड़ाई के एक सीधी रेखा के साथ एम्बेडेड पैमाने बार ढ़कें. लेबल टैब से "सेट" स्केल का चयन करें "विश्लेषण." "ज्ञात दूरी बॉक्स में, इसी लंबाई (के रूप में मूल पैमाने पट्टी से निर्धारित है, यानी, 2 मिमी) सम्मिलित करें और चुनें" ठीक है ". "सीधे लाइन" स्थान के पार एक क्षैतिज रेखा सम्मिलित करने के लिए इस विकल्प का उपयोग करें. विश्लेषण टैब के तहत, "उपाय" का चयन करें. नए परिणाम विंडो में, गणना की लंबाई प्रदान किया जाएगा. मौके भर में एक सीधा लाइन डालने के द्वारा एक दूसरे माप प्राप्त करते हैं. व्यास को पुनः गणना. दो माप का औसत रिकार्ड. हर बार एक्सेल जैसे एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर बिंदु पर प्रत्येक स्थान के लिए औसत व्यास ग्राफ. प्रयोग के अंत होता है या तो एक निर्दिष्ट समय के बिंदु पर या जब कोई आगे हैbiofilm का विकास. एक बार अंत तक पहुँच जाता है, () आंकड़ा ऐसी पावरपोइंट रूप में एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर समय पर पैटर्न विकास की कल्पना में छवियों को मजबूत. 3. प्रतिनिधि परिणाम हम इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया वी. एक मॉडल के लिए एक ठोस अगर सतह पर झुर्रियों कालोनियों के विकास का मूल्यांकन द्वारा biofilm गठन का अध्ययन जीव के रूप में fischeri. वी. के biofilm उत्पादन उपभेदों fischeri व्यापक 3 डी वास्तुकला के साथ 40 घंटे के भीतर के फार्म कालोनियों छवि (1) 8,9,14. जब एक समय के पाठ्यक्रम पर जांच की, यह स्पष्ट हो जाता है कि नियंत्रण तनाव झुर्रियों कॉलोनी गठन के रूप में के बारे में 12 के रूप में जल्दी शुरू घंटे के बाद टीका (विशिष्ट शर्तों पर निर्भर करता है) (छवि 2) 9. इसके विपरीत, एक प्रतिनिधि उत्परिवर्ती द्वारा biofilm गठन लगभग 4 घंटे की देरी हो रही है, लगभग 16 के बाद टीका घंटे 9 तक नहीं की शुरुआत. Repeaइन प्रयोगों के टीएस सुझाव दिया कि समय अपेक्षाकृत अनुरूप था, इस आकलन 9 अर्द्ध मात्रात्मक. Biofilm गठन के दूसरे अर्द्ध मात्रात्मक उपाय समय के साथ विकसित कॉलोनी के व्यास में परिवर्तन का उपयोग करता है. के रूप में चित्र में दिखाया गया है. 3A, एक प्रतिनिधि तनाव biofilm से सक्षम कालोनियों रूपों है कि जटिलता और एक प्रतिनिधि तनाव है कि biofilms फार्म नहीं करता है के सापेक्ष व्यास में वृद्धि हुई है. इन दो उपभेदों द्वारा गठित कालोनियों के व्यास के समय अधिक सावधान माप से पता चला है कि biofilm से सक्षम कालोनियों का आकार biofilm से नकारात्मक कालोनियों से अधिक दर से वृद्धि हुई है, और अंत समय बिंदु पर लगभग 2 दो मतभेद गुना (3B चित्र). इस प्रकार, हालांकि एक प्रतिनिधि देर समय या "अंत बिंदु" कॉलोनी आकारिकी की छवियों को अक्सर साहित्य में दिखाए जाते हैं, अतिरिक्त, अर्द्ध मात्रात्मक डेटा एकत्र किया है कि biofilm दोष का एक बेहतर समझ की अनुमति देगा कर सकते हैं. चित्रा 1 परख अंत बिंदु. यह आंकड़ा परख अंत बिंदु का एक उदाहरण वी. के प्रतिनिधि (बाएं) गैर biofilm से बनाने और biofilm के गठन (दाएं) उपभेदों का उपयोग fischeri. इन छवियों में एकत्र किए गए 40 घंटे के बाद खोलना. इन छवियों को जंगली प्रकार वी. के साथ उत्पन्न किया गया fischeri एक सदिश (गैर biofilm गठन) नियंत्रण या डेटा सेट मॉरिस एट अल, 2011 के लिए एकत्र की एक rscS (biofilm बनाने) overexpressing प्लाज्मिड थे और हिस्सा शामिल है. चित्रा 2. परख पाठ्यक्रम. ऊपरी पैनल नियंत्रण biofilm से सक्षम के तनाव से biofilm गठन की छवियों प्रतिनिधि शामिल वी. चयनित समय के पाठ्यक्रम पर fischeri. Biofilm गठन की शुरूआत 12 घंटे में स्पष्ट है. कम पैनल प्रतिनिधि मैं शामिलवी. के एक उत्परिवर्ती तनाव के mages fischeri कि समय के साथ झुर्रियों कॉलोनी गठन के शुरू में (4 घंटे), 16 के बाद टीका घंटे में biofilm गठन की शुरुआत के साथ देरी को दर्शाती है. ध्यान दें कि 40 घंटे में उपभेदों और biofilm गठन की तीव्रता patterning के समान लग रही है, जबकि इन उपभेदों के बीच सूक्ष्म अंतर केवल पहले समय बिंदुओं पर मनाया जाता है. इन छवियों rscS जंगली प्रकार overexpressing और sypE उत्परिवर्ती के साथ उत्पन्न थे वी. fischeri कोशिकाओं और डेटा का हिस्सा थे मॉरिस एट अल, 2011 के लिए एकत्र सेट. चित्रा 3. Biofilm गठन की एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में कॉलोनी व्यास. (ए) biofilm गठन की प्रतिनिधि biofilm (ऊपरी पैनल) के गठन और गैर biofilm गठन वी. (कम पैनल) उपभेदों द्वारा समय पाठ्यक्रम fischeri. ध्यान दें कि तनाव biofilm गठन एक बड़ा वृद्धि दर्शाती हैगैर biofilm गठन तनाव के सापेक्ष समय के साथ व्यास में. इन छवियों को जंगली प्रकार वी. के साथ उत्पन्न किया गया डेटा के एक rscS (biofilm बनाने) overexpressing प्लाज्मिड या एक वेक्टर नियंत्रण (गैर biofilm गठन) थे और भाग युक्त fischeri सेट मॉरिस एट अल, 2011 के लिए एकत्र. (बी) के पैनल ए में दो उपभेदों इन डेटा ImageJ और एक्सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न किया गया प्रोटोकॉल के रूप में उल्लिखित द्वारा समय पर व्यास कॉलोनी में वृद्धि का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व है.

Discussion

इस काम में, हम एक अर्द्ध मात्रात्मक biofilm गठन का उपयोग का आकलन विधि का वर्णन वी. एक मॉडल जीव के रूप में fischeri. विशेष रूप से, हम कैमरा अनुलग्नक के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप biofilm गठन और एक ठोस अगर सतह पर समय पर झुर्रियों कॉलोनी गठन के रूप में विकास की निगरानी का उपयोग. इस प्रोटोकॉल में, हम तरीकों के दो विशिष्ट प्रकार हम आमतौर पर झुर्रियों कॉलोनी गठन का आकलन उपयोग रूपरेखा. पहली परख अंत बिंदु है, जो हमें एक चयनित "अंतिम समय बिंदु पर अंतिम समग्र 3 डी वास्तुकला, patterning, और एक देखा संस्कृति के व्यास का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण के सबसे उत्परिवर्ती उपभेदों या स्थिति है कि biofilm गठन में नाटकीय दोष करने के लिए नेतृत्व का आकलन करने के लिए उपयोगी है. हालांकि, इस दृष्टिकोण अधिक सूक्ष्म चयनित अंत बिंदु से पहले समय बिंदुओं पर होने वाली मतभेद के बीच भेद नहीं करता. को और अधिक बारीकी से झुर्रियों कॉलोनी गठन पर नजर रखने के लिए, हम एक बार पाठ्यक्रम परख है, जो हमें w की शुरुआत की पहचान करने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करेंकॉलोनी गठन और समय के साथ इसके विकास घड़ी rinkled. इस दृष्टिकोण का एक परिणाम के रूप में, झुर्रियों कॉलोनी गठन, 3 डी वास्तुकला, और patterning के समय में और अधिक सूक्ष्म अंतर पहचाना जा सकता है. हम इस समय बेशक परख इस्तेमाल करने के लिए दो biofilm गठन की अर्द्ध मात्रात्मक assays उत्पन्न. सबसे पहले, समय है, जिस पर तनाव के लिए 3 डी वास्तुकला का विकास शुरू होता है कि नियंत्रण उपभेदों के तुलना की जा सकती है. हमने पाया है कि एक ही परिस्थितियों में एक विशेष उत्परिवर्ती की biofilm गठन में देरी काफी सुसंगत है ^9. उदाहरण के लिए, चित्र में दिखाया गया डेटा में. 2, उत्परिवर्ती लगातार 4 घंटे biofilm गठन की शुरुआत में देरी के बारे में प्रदर्शन किया. Biofilm गठन के दूसरे अर्द्ध मात्रात्मक उपाय झुर्रियों कॉलोनी (स्थान) के व्यास के आकार में परिवर्तन है. हमने पाया है कि झुर्रियों कालोनियों का व्यास उत्तरोत्तर गैर biofilm कालोनियों की कि से अलग है, अंत समय बिंदु पर एक 2 गुना अंतर के बारे में पहुँच (छवि 3 </strong>) (मॉरिस और Visick के अप्रकाशित डेटा). तिथि करने के लिए, हम (यानी, biofilm गठन कॉलोनी व्यास में वृद्धि के बिना) अन्य (अप्रकाशित डेटा) के बिना एक फेनोटाइप नहीं मनाया है, हालांकि यह संभव है कुछ म्यूटेंट अलग व्यवहार करेंगे. वास्तव में, यह वी. के लिए सूचित किया गया है कोलरा कि कॉलोनी व्यास में पर्याप्त वृद्धि में कुछ झुर्रियों कालोनियों परिणाम ¹⁵ जबकि दूसरों को नहीं है. फिर भी, समय के साथ व्यास में परिवर्तन का आकलन संभावित biofilm म्यूटेंट और / के लक्षण वर्णन में सहायता या म्यूटेंट के विकास में देरी के साथ एक अतिरिक्त मात्रात्मक उपाय प्रदान कर सकता है. Biofilm गठन के दो उपाय (समय और व्यास), झुर्रियों कॉलोनी निर्माण की शुरुआत का निर्धारण और अधिक संवेदनशील है, लेकिन यह भी अधिक व्यक्तिपरक स्थान के व्यास का निर्धारण करने से. फिर भी, दोनों उपायों phenotype की एक अर्द्ध मात्रात्मक आकलन है कि biofilm शोधकर्ताओं के लिए अत्यंत उपयोगी है, लेकिन quantificatio आसानी से उत्तरदायी नहीं है प्रदान करते हैंएन.

जब देखा सुसंस्कृत assays के प्रदर्शन, यह पर्यावरण की स्थिति में जो देखा उपभेदों संवर्धित कर रहे हैं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. झुर्रियों वाली कॉलोनी गठन अक्सर पोषक तत्वों की उपलब्धता, तापमान, नमी और सहित विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों से प्रभावित है. प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह उपयोगी है इन स्थितियों के मानकीकृत बहुत संभव के रूप में (यानी एक सेट मात्रा अगर प्लेट मानकीकरण और एक नियंत्रित तापमान पर देखा उपभेदों संवर्धन). खोलना प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता के लिए आगे को नियंत्रित करने के लिए, महत्वपूर्ण है प्रयोगों के प्रत्येक सेट के भीतर उचित नियंत्रण उपभेदों शामिल है. अंत में, जब इन assays के से डेटा की व्याख्या, यह आवश्यक है किसी भी एक प्रयोग कई बार (3), प्रदर्शन विशेष रूप से जब झुर्रियों कॉलोनी गठन में सूक्ष्म अंतर (जैसे, biofilm गठन या patterning के मतभेद में देरी) का आकलन है. इस प्रोटोकॉल के कुछ सीमाएँ हैं: 1) determinआईएनजी चाहे कोशिकाओं के विकास में एक दोष है मुश्किल हो सकता है: तरल संस्कृति में कोशिकाओं के विकास को सही ठोस मीडिया पर विकास दर, और biofilm कोशिकाओं के गठन, जो एक साथ रहना संभव नहीं हो सकता है हो सकता है की विकास की एक सटीक दृढ़ संकल्प को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते; 2) वृद्धि दोष के साथ तनाव का विश्लेषण करने के लिए समस्याग्रस्त हो जाएगा, 3) यह संभव नहीं हो सूक्ष्म biofilm phenotypes साथ व्यास उपभेदों के बीच मतभेद भेद सकता है, 4) उपभेदों कि एक गाढ़ा अंगूठी में जाना नहीं है के लिए यह संभव नहीं होने के लिए सही उपाय हो सकता है व्यास में परिवर्तन, 5) जबकि patterning biofilm गठन के दौरान देखा जा सकता है, वहाँ कोई परिणामस्वरूप biofilm की patterning यों रास्ता है, और 6) वहाँ कोई प्रयोगात्मक सेट अप के साथ biofilm की Z आयाम को मापने के तरीके . इन सीमाओं के बावजूद, इस प्रोटोकॉल फिर भी एक संख्यात्मक डेटा प्राप्त को झुर्रियों कॉलोनी गठन का आकलन करने में सहायता करने का साधन प्रदान करता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम एक विशिष्ट इमेजिंग का उपयोगप्रणाली (यानी, एक Zeiss विदारक माइक्रोस्कोप और Progres CapturePro इमेजिंग सॉफ्टवेयर) का निरीक्षण करने के लिए और झुर्रियों कॉलोनी गठन का मूल्यांकन. इमेजिंग प्रणाली यहाँ वर्णित शक्तिशाली है: झुर्रियों कॉलोनी गठन की शुरुआत का पता लगाने, और इस प्रकार एक समय पाठ्यक्रम दृष्टिकोण के साथ विकास का आकलन करने की क्षमता है, बहुत विदारक माइक्रोस्कोप के प्रयोग के माध्यम से बढ़ाया है. हालांकि, अगर इस तकनीक अनुपलब्ध है, प्रोटोकॉल एक ज़ूम ध्यान केंद्रित के साथ एक सरल डिजिटल कैमरा सहित अन्य उपकरणों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि यह प्रोटोकॉल झुर्रियों कॉलोनी विकास के मूल्यांकन पर केंद्रित है, यह भी पतली झिल्ली गठन, मूल्यांकन biofilm का एक रूप है कि जब कोशिकाओं को स्थिर रुप से तरल संस्कृति में बढ़ रहे हैं विकसित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल biofilm गठन की biofilm विकास के दौरान देखा कालोनियों में विशिष्ट रंगों के समावेश सहित अन्य संकेतक, आकलन करने में भी उपयोगी साबित हो सकता है. ये शामिल हैं, लेकिन करने के लिए, कांगो लाल और calcoflu जैसे रंगों सीमित नहीं हैंया जो सेलूलोज़, जीवाणु biofilms के एक आम ¹⁶ घटक के लिए बाध्य कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल, हालांकि इस्तेमाल के लिए विकसित वी. fischeri, इस जीव के लिए सीमित नहीं है, लेकिन बेसिलस ⁴ subtilis, विब्रियो कोलरा ^5, विब्रियो ^६ parahaemolyticus, और Pseudomonas aeruginosa ^7, जो एक्ज़िबिट झुर्रियों कॉलोनी गठन जैसे कई अलग अलग जीवों में biofilm गठन का अध्ययन करने के लिए सामान्यीकृत हो सकता है. अंत में, यह भी अन्य कॉलोनी morphologies है कि इस तरह के संभावित patterning, कि स्यूडोमोनास ¹⁸ aeruginosa में Myxococcus ¹⁷ ज़ेंथस और हवाई संरचना विकास के दौरान होता है के रूप में विकास पैटर्न, का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सूक्ष्म जीव विज्ञान और biofilm शोधकर्ताओं के लिए सामान्य उपयोग की इस प्रकार है.

Materials

Name of Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope	Zeiss	45505300000000000	(obtained through Lukas Microscope)
ProgRes C10PLUS	JENOPTIK Optical Systems GmbH	017953-602-26	Camera attachment (obtained through Lukas Microscope)
CL 1500 EC Cold Light Source	Zeiss	4355400000000000	(obtained through Lukas Microscope)
ProgRes CapturePro	JENOPTIK Optical Systems GmbH	Free software with registered camera	Computer program for image capture
Image J	NIH	Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html	Computer program for diameter measurements