Vi tillhandahåller en enkel, semi-kvantitativ metod för att undersöka biofilmbildning<em> In vitro</em>. Denna metod drar fördel av Zeiss STEMI 2000-C dissekeringsmikroskop (med kamera bilaga) att övervaka både tidpunkten för och mönster biofilm bildning, enligt bedömning av utvecklingen av skrynkliga kolonier.
Biofilmer eller yt-anslutna gemenskaper av celler inkapslade i en extracellulär matris, utgöra en gemensam livsstil för många bakterier. Inom en biofilm, ofta bakterieceller uppvisar förändrats fysiologi, inklusive förbättrad motståndskraft mot antibiotika och andra miljöpåfrestningar 1. Dessutom kan biofilmer spelar viktiga roller i värd-mikrob interaktioner. Biofilmer utvecklas när bakterier övergången från individ till planktonceller bilda komplexa, multi-cellulära samhällen 2. I laboratoriet är biofilmer studeras genom att bedöma utvecklingen av specifika biofilm fenotyper. Ett vanligt biofilmen fenotyp innefattar bildningen av rynkiga eller rynkig bakteriella kolonier på fast agar medium 3. Skrynkliga kolonibildning ger en synnerligen enkel och användbart sätt att identifiera och karaktärisera bakteriestammar uppvisar förändrade biofilm fenotyper, samt att undersöka miljömässiga förhållanden som påverkar biofilm formation. Wrinkled kolonibildning tjänar som en indikator av biofilmbildning i en mängd olika bakterier, inklusive både Gram-positiva bakterier, såsom Bacillus subtilis 4 och Gram-negativa bakterier, såsom Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, och Vibrio fischeri 8.
Den marina bakterien V. fischeri har blivit en modell för biofilm formation på grund av den kritiska roll biofilmer under host kolonisering: biofilmer produceras av V. fischeri främja dess kolonisering av Hawaiian Bobtail bläckfisk Euprymna scolopes 8-10. Viktigt är att biofilmen fenotyper observerades in vitro korrelerar med förmågan hos V. fischeri celler för att effektivt kolonisera värddjur: stammar kränkas i biofilm formation in vitro har en kolonisering defekt 9,11, medan stammar uppvisar en ökadbiofilm fenotyper förbättras för kolonisation 8,12. V. fischeri ger därför en enkel modell för att bedöma de mekanismer genom vilka bakterier reglerar biofilm formation och hur biofilmer påverkan värd kolonisering.
I denna rapport beskriver vi en semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilm bildning med V. fischeri som modellsystem. Denna metod involverar noggrann observation av bakteriella kulturer vid definierade koncentrationer och volymer på fasta agarmedia; en fläckig kultur är synonymt med en enskild bakteriekoloni. Denna "spotted kultur" teknik kan användas för att jämföra brutto biofilm fenotyper vid enstaka, specifika tidpunkter (end-point analyser), eller för att identifiera och karaktärisera subtila biofilm fenotyper genom tiden-rätters analyser av biofilm utveckling och mätningar av kolonin diametern , vilken är påverkad av biofilmbildning. Således tillhandahåller denna teknik en semikvantitativ analys av biofilmbildning permitting utvärdering av timing och mönstring av rynkig koloni utveckling och den relativa storleken i utvecklingsländerna struktur, egenskaper som sträcker sig utanför den enkla totala morfologi.
I detta arbete beskriver vi en semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilm bildning med V. fischeri som modell organism. Specifikt använder vi ett dissektionsmikroskop med kamera fäste för att övervaka biofilm bildning och utveckling som rynkig kolonibildningen över tiden på en fast agarytan. I detta protokoll, beskriva vi två specifika typer av metoder vi vanligtvis använder för att bedöma skrynkliga kolonibildning. Den första är slutpunkten analys, som tillåter oss att följa finalen, totalt 3D arkitektur, mönstring och diametern på en fläckig kultur i en utvald "sista" tidpunkt. Detta tillvägagångssätt är mest användbar för att bedöma mutantstammar eller tillstånd som leder till dramatiska defekter i biofilmbildning. Men skiljer detta tillvägagångssätt inte mellan mer subtila skillnader som förekommer vid tidpunkter före den valda slutpunkten. För att mer noggrant övervaka skrynkliga kolonibildning, använder vi en analys tidsförloppet för detta, som tillåter oss att identifiera början av wrinkled kolonibildning och titta dess utveckling över tiden. Som en följd av detta synsätt, kan mer subtila skillnader i tidpunkten för skrynkliga kolonibildning, 3D arkitektur och mönstring identifieras. Vi använde denna analys tidsförloppet för att generera två semi-kvantitativa analyser av biofilm formation. Först kan den tidpunkt vid vilken en stam börjar utvecklas 3D arkitektur skall jämföras med den hos kontroll-stammarna. Vi har funnit att den försenade biofilmbildning av en särskild mutant under samma betingelser är tämligen konsekvent 9. Till exempel, i de data som visas i fig.. 2 uppvisade mutanten genomgående om en 4 timmars försening i att initiera biofilm formation. En andra halv-kvantitativ mätning av biofilmbildning är förändringen i storlek av diametern hos den skrynklade koloni (fläck). Vi har funnit att diametern hos rynkiga kolonier progressivt skiljer sig från den hos icke-biofilm kolonier och nådde omkring en 2-faldig skillnad i slutet tidpunkt (fig. 3 </strong>) (Morris och Visick, opublicerade data). Till dags dato har vi observerat inte en fenotyp utan den andra (dvs. bildning av biofilm utan en ökning i koloniantal diameter) (opublicerade data), även om det fortfarande är möjligt vissa mutanter kommer att bete sig på olika sätt. I själva verket har det rapporterats för V. cholerae att vissa skrynkliga kolonier resulterar i en betydande ökning kolonin diameter, medan andra inte gör det 15. Ändå kan bedöma förändringen i diameter över tiden hjälpa till karakterisering av potentiella biofilm mutanter och / eller tillhandahålla en ytterligare kvantitativ mätning av mutanter med förseningar i utvecklingen. Av de två mått på biofilm bildning (tid och diameter), bestämma i början av skrynkliga kolonibildning är mer känslig, men också mer subjektiva, än att fastställa diameter plats. Ändå båda åtgärderna ger en semi-kvantitativ bedömning av en fenotyp som är extremt användbar för biofilm forskarna, men inte lätt mottaglig för quantification.
När du utför fläckiga odlade analyser är det viktigt att beakta de miljömässiga förhållanden under vilka fläckiga stammar odlas. Skrynkliga kolonibildning ofta påverkas av olika miljöfaktorer, bland annat tillgången på näringsämnen, temperatur och luftfuktighet. För att minska variabiliteten mellan experiment, är det bra att standardisera dessa villkor så mycket möjligt (dvs. att standardisera agarplattorna till en viss volym och odling av fläckiga stammar vid en kontrollerad temperatur). För att ytterligare kontroll för variation mellan spotting experiment är viktigt att lämpliga kontrollåtgärder stammarna inom varje uppsättning av experiment. Slutligen, när tolkningen av data från dessa analyser, är det nödvändigt att utföra någon experiment flera gånger (3 +), särskilt vid bedömningen subtila skillnader i skrynkliga kolonibildning (t.ex. en försening i biofilm formation eller skillnader mönstring). Vissa begränsningar i detta protokoll är: 1) fastställbaraIng om celler har en defekt i tillväxten kan vara svårt: tillväxt av celler i flytande kultur kan inte exakt avspegla tillväxttakten på fasta medier, och en noggrann bestämning av tillväxt av biofilm-bildande celler, som kan hålla ihop, kanske inte möjligt, 2) stammar med tillväxt defekter kommer att vara problematiskt att analysera, 3) det kanske inte möjligt att skilja diameter skillnader mellan stammar med subtila biofilm fenotyper, 4) för stammar som inte växer i en koncentrisk ring det inte vara möjligt att noggrant mäta förändringar i diameter, 5) medan mönstring kan observeras under bildning av biofilm, finns det inget sätt att kvantifiera den mönstring av den resulterande biofilmen, och 6) finns det inget sätt att mäta den Z-dimensionen av biofilmen med denna experimentella uppställning . Trots dessa begränsningar ger detta protokoll ändå ett sätt att få numeriska data för att underlätta bedömningen av skrynkliga kolonibildning.
I detta protokoll, använder vi en viss avbildningsystem (dvs. en Zeiss dissektionsmikroskop och Progres CapturePro bildbehandlingsprogram) för att observera och utvärdera skrynkliga kolonibildning. Den avbildande system som beskrivs här är kraftfullt: förmågan att upptäcka i början av skrynkliga kolonibildning och därmed bedöma utvecklingen med ett tidsförlopp tillvägagångssätt kraftigt förbättras genom användning av ett dissektionsmikroskop. Men om denna teknik inte är tillgänglig, kan protokollet anpassas för användning med annan utrustning, inklusive en enkel digital kamera med en zoom fokus. Även om detta protokoll fokuserar på bedömning av rynkiga koloni utvecklingen kan det också ändras för att utvärdera hinna bildas, en form av biofilm som utvecklar när celler växer statiskt i flytande kultur. Detta protokoll kan också visa sig användbar vid bedömningen andra indikatorer på biofilm bildning, inklusive införlivandet av specifika färgämnen i fläckiga kolonierna under biofilm utveckling. Dessa innefattar, men är inte begränsade till, färgämnen såsom kongorött och calcoflueller som kan binda till cellulosa, en vanlig komponent i bakteriella biofilmer 16. Dessutom detta protokoll, även utvecklats för att användas med V. fischeri, är inte begränsad till denna organism, men kan generaliseras till att studera biofilmbildning i många olika organismer, såsom Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, och Pseudomonas aeruginosa 7, vilka alla uppvisar rynkig kolonibildning. Slutligen också kan anpassas för att studera andra kolonimorfologier som har en utvecklande mönster, såsom potentiellt, mönstringen som sker under tillväxt Myxococcus Xanthus 17 och antennen struktur utveckling i Pseudomonas aeruginosa 18. Detta protokoll är därför av allmänt bruk på mikrobiologi och biofilm forskare.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NHI R01 bidrag GM59690 tilldelas KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |