Transplantation av pankreasöarna in i njuren Capsule av diabetiska möss
Summary
Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel möss. Celler är koncentrerade till pellets i den slutliga slangar som används för omplantering cellerna i njuren kapsel. Enkelheten i denna teknik minskar stressen till cellerna och musen.
Abstract
Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Vi fann att det var lättare att koncentrera insulinproducerande celler eller till pellets i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njuren kapsel. Denna teknik ger både snabbt och enkelt samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.
Laddar: Fast, plockade handen, holmar eller pelleterat celler noggrant aspirerade från botten av en 1,5 ml mikrocentrifugrör med en P200 pipetteman och en rak, tunnväggigt pipettspetsen. En längd på PE50 slangen är fäst vid pipettspetsen med en liten slang silikon adapter. Celler har rätt att bosätta sig i spetsen, och sedan överförs till PE50 slangen genom att långsamt slå pipetteman. När cellerna är nära slutet av PE50 rör, är en knut göras och silikon adaptern slangen placeras över knut. Den PE50 slangen förs över till en 15 ml E innehåller ett snitt 5 ml pipett och PE50 slangen är tejpade över den sida av 5 ml pipett för att förhindra curling under centrifugering. Celler är tillåtna för att nå 1000 rpm och stannade.
Transplantation: Mottagarens möss är sövda, rakade, och rengöras. Ett litet snitt görs på den vänstra flanken av musen och njurarna är utsatt. Njuren, fett och vävnad hålls fuktig med fysiologisk koksaltlösning provstickan. Den distala änden av PE50 är ansluten till en Hamilton skruv köra sprutan, som innehåller en pipettspets, med hjälp av slangen silikon adaptern. En liten nick görs på den högra flanken sida av njuren, inte för stora eller för djupt. Den avfasade änden av PE50 rör, närmast celler, noggrant placeras under kapseln är slangen flyttas runt försiktigt för att ge plats medan badda koksaltlösning, en torr kapsel kan riva lätt. En liten luftbubbla levereras under kapseln genom att långsamt slå kör sprutan skruven. Holmar är sedan långsamt levereras bakom luftbubbla. När holmar har levererats njure homeostas upprätthålls och Knick är flamberats med låg temperatur. Njuren placeras tillbaka in i hålrummet och bukhinna och hud är sys och häftas. Möss är omedelbart behandlas med Flunixin och Buprenorfin kvm och placeras i en bur på en värmedyna.
Protocol
Discussion
Detta protokoll ger ett praktiskt och effektivt alternativ för snyggt och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Tekniken att koncentrera och pelletering av insulinproducerande celler eller i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njurarna kapsel erbjuder en enkel och effektiv metod att transplantera celler samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.
Acknowledgements
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson-företag.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Surgical gloves | Fisher | 11-394-95(sz) | ||
| Surgical scrub sponges | Moore medical | 42940AK | ||
| Forceps | Miltex | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight | |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex | 5-290 | ||
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher | 01-305-10B | ||
| 4×4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | ||
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | ||
| Alcohol pads | Fisher | 14-819-2 | ||
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | ||
| 23G or 25G needles | 1″ long | |||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments | |
| PE50 polyethylene tubing | BD | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. | |
| Cidex + 28 day soln | Moore | 35625AK | ||
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID | |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | ||
| Straight Pipet Tips | TipOne | 1111-0810 | sterile | |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton | 1001 | ||
| Cauterizing tool | Roboz | RS230 | ||
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | ||
| 5-0 silk | Look | 754B | for suture (6-C) | |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | |||
| 9mm autoclip stapler | BD | 7630 | ||
| 9mm staples | BD | 7631 | ||
| 9mm staple remover | BD | 7637 |
Referências
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
