En bekväm och General uttryck plattform för produktion av utsöndrade proteiner från humana celler
Summary
I den post-genomik eran är tillgången av rekombinanta proteiner i nativa konformationer avgörande för strukturella, funktionella och terapeutisk forskning och utveckling. Här beskriver vi ett test-och storskaliga proteinuttryck system i humana embryonala njurceller 293T som kan användas för att tillverka en mängd olika rekombinanta proteiner.
Abstract
Rekombinant proteinuttryck i bakterier, typiskt E. coli, har varit den mest framgångsrika strategin för milligram mängden uttryck av proteiner. Emellertid prokaryota värdar är ofta inte lika lämpliga för uttryck av humana, virala eller eukaryota proteiner på grund av toxiciteten hos det främmande makromolekyl, skillnader i proteinets veckning maskinen, eller på grund av avsaknaden av särskilda co-eller post-translationella modifieringar i bakterier. Expressionssystem baserade på jäst (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, bakulovirus-infekterade insektsceller (S. frugiperda eller T. ni) celler 3, och cellfria in vitro-translation system 2,4 har med framgång använts för att producera däggdjursproteiner. Intuitivt, är den bästa matchningen att använda en däggdjursvärd för att säkerställa produktion av rekombinanta proteiner som innehåller de korrekta posttranslationella modifieringar. Ett antal däggdjurscellinjer (Humana embryonala KidNey (HEK) 293, har C V-1-celler i O rigin bär S V40 larget T-antigen (COS), kinesisk hamsterovarie (CHO), och andra) har med framgång används för att överuttrycka milligrammängder av ett antal humana proteiner 5-9. Emellertid är fördelarna med att använda däggdjursceller ofta motverkas av högre kostnader, krav på speciell laboratorieutrustning, lägre utbyten protein, och de långa för att utveckla stabila linjer expressionssystem cell. Ökad avkastning och producerar proteiner snabbare, samtidigt som kostnaderna hålls låga, är viktiga faktorer för många akademiska och kommersiella laboratorier.
Här beskriver vi ett tids-och kostnadseffektiv, två delar förfarande för uttrycket av utsöndrade humana proteiner från fastsittande HEK 293T-celler. Detta system är kapabel att producera mikrogram till milligrammängder av funktionellt protein för strukturella, biofysikaliska och biokemiska studier. Den första delen, flera konstruktioner av genen av intresse är gerd parallellt och övergående till vidhäftande HEK 293T-celler i liten skala. Detektering och analys av rekombinant protein som utsöndras i cellodlingsmediet utförs genom western blot-analys med användning av kommersiellt tillgängliga antikroppar riktade mot en vektor-kodade proteinet rening tagg. Därefter lämpliga konstruktioner för storskalig proteinproduktion transfekterades transient med användning polyetylenimin (PEI) i 10-skikt cellfabriker. Proteiner utsöndrade in liters-volymer av konditionerat medium koncentreras till hanterbara mängder med användning tangentiell flödesfiltrering, följt av rening av anti-HA-affinitetskromatografi. Användbarheten av denna plattform bevisas av dess förmåga att uttrycka milligrammängder av cytokiner, cytokinreceptorer, cellytreceptorer och inneboende faktorer restriktionsställen och virala glykoproteiner. Denna metod har också framgångsrikt använts vid strukturell bestämning av de trimera 5,10 ebolavirus glykoprotein.
<p class = "jove_content"> Sammanfattningsvis ger denna plattform användarvänlighet, snabbhet och skalbarhet och maximera protein kvalitet och funktionalitet. Vidare är ingen ytterligare utrustning som inte är en vanlig befuktad CO2-inkubator, som krävs. Detta förfarande kan snabbt utökas till system med större komplexitet, till exempel sam-expression av proteinkomplex, antigener och antikroppar, produktion av virusliknande partiklar för vacciner, eller produktion av adenovirus eller lentivirus för transduktion svåra cellinjer.Protocol
Discussion
De 10-skikt cellfabriker är en effektiv kärl för produktion av milligrammängder av proteinet. En stor fördel med att använda cellfabrik framför andra traditionella kärl, såsom rullflaskor, kolvar skaka eller spinnkolvar, är att de inte kräver att köpa ytterligare laboratorieutrustning. En standard CO 2-inkubator (ca 6,0 cu. Fot) kommer lätt rymma fyra 10-lagers cellfabriker (Fig. 2). Dessutom är dessa kärl kräver mindre arbetskraft och utrymme än skålar, flaskor eller rullfl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Ontario hiv-behandling Network Research driftsbidrag (ROG-G645) och kanadensiska Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113.554) för att JEL och University of Toronto stipendier till HA, FCA, och JDC. Författarna vill tacka Marnie Fusco, Dafna Abelson och Dr Erica Ollmann Saphire på The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) för att ge celler, ebolavirus GP expressionsvektor och allmänna råd.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
Referências
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
