İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu
Summary
Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.
Abstract
Bakterilerde rekombinant protein ekspresyonu, tipik E. coli, proteinlerin miligram miktarı ifadesi için en başarılı bir strateji olmuştur. Bununla birlikte, çoğu zaman prokaryotik hosts bakteriler, özellikle co-veya post-translasyon modifikasyonların eksikliğinden kaynaklanan, insan, viral veya ökaryotik yabancı makromolekülün toksisite bağlı proteinler, protein katlama makine farklılıklar, ya da ifade için uygun değildir. Maya (P. pastoris ya S. cerevisiae), 1,2,-bakülovirüs bulaştırılmış böcek (S. frugiperda veya T. ni) hücreler 3, in vitro ve de sistemleri için hücre içermeyen temel ekspresyon sistemleri 2,4 başarıyla için kullanılmıştır memeli proteinleri üretmek. Muhtemelen iyi eşleşme post-translasyon uygun değişiklikler içeren rekombinant proteinlerin üretimini sağlamak için bir memeli konak kullanmaktır. Memeli hücre çizgileri (insan embriyonik Çocuk bir diziney (HEK) 293, S V40 larget T-antijen (COS), Çin Hamsteri Över (CHO), ve diğerleri taşıyan O rigin C V-1 hücreleri) başarılı bir şekilde insan proteinleri bir dizi miligram miktarlarda olarak artmış için kullanılmıştır 5-9. Ancak, memeli hücrelerinde kullanmanın avantajları genellikle istikrarlı ifade hücre hatları geliştirmek için yüksek maliyetleri, özel laboratuvar ekipman ihtiyacı, düşük protein verimi ve uzun zamanlar göre karşılık. Maliyetleri düşük tutarken, daha hızlı verim ve üretim protein artırılması, pek çok akademik ve ticari laboratuarlar için önemli faktörlerdir.
Burada, bir zaman ve yapışık HEK 293T hücrelerinden salgılanan insan proteinlerinin ifadesi için maliyet-etkin, iki bölümlü bir prosedür tanımlamaktır. Bu sistem, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar için işlevsel proteinin miligram miktarda mikrogram üretme kapasitesine sahiptir. İlk bölümde, ilgi genin birden yapıları üretmek vardırparalel ve geçici olarak küçük ölçekli yapışık HEK 293T hücrelerine transfekte d. Hücre kültürü aracı maddesine salgılandı rekombinant protein saptama ve analiz Bir vektör olarak kodlanmış proteine karşı yöneltilmiş saflaştırma etiketi ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak Western blot analizi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, büyük ölçekli bir protein üretime uygun yapıları geçici 10-tabaka hücre fabrikalarda polietilenimin (PEI) ile transfekte edilir. Şartlandırılmış orta litrelik-hacim içine salgılanan proteinler, anti-HA afinite kromatografisi ile saflaştırma, ardından teğet akış filtrasyonu kullanılarak kontrol edilebilir miktarlar halinde konsantre edilmiştir. Bu platformun programı sitokinler, sitokin reseptörleri, hücre yüzey reseptörleri, içsel kısıtlama faktörler ve viral glikoproteinler miligram miktarlarda ifade yeteneğini kanıtladı. Bu yöntem de başarılı bir şekilde trimeric ebolavirus glikoprotein 5,10 yapısal tayini kullanılmıştır.
<p class = "jove_content"> Sonuç olarak, bu platform protein kalitesi ve işlevsellik maksimize ederken kullanımı, hız ve ölçeklenebilirlik kolaylığı sunuyor. Dahası, bir standart nemlendirilmiş CO2 inkübatöründe haricinde hiçbir ilave ekipman, gereklidir. Bu prosedür, hızlı protein kompleksleri, antijenler ve antikorlar, aşılar için üretim virüse benzer parçacıklar, ya da zor bir hücre hatları transdüksiyonu için adenovirüsler ya Lentivirüs üretimi müşterek ifadesinden olarak daha büyük bir karmaşıklık sistemleri için genişletilebilir.Protocol
Discussion
10 katmanı hücre fabrikalarda protein miligram miktarlarda üretilmesi için etkili bir kap olup. Bu tür roller şişeleri, erlenlere veya spinner matara gibi diğer geleneksel gemiler, üzerinde hücre fabrika kullanarak önemli bir avantajı da herhangi bir ek laboratuar ekipman alımı gerekmez olmasıdır. Standart bir CO 2 inkübatör (~ 6.0 cu. Ft) kolayca dört adet 10-katmanlı hücre fabrikalar (Şekil 2) uygun olacaktır. Buna ek olarak, bu kapların tabaklar, şişeler ya hücre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma HA, FCA ve JDC bir Ontario HIV Tedavi Araştırma Ağı İşletim Grant (ROG-G645) ve Sağlık Araştırması Yeni Araştırmacı Ödülü (MSH-113.554) Kanada Enstitüleri JEL, ve Toronto Bursu Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar sağlayan hücreler, ebolavirus GP ekspresyon vektörü ve genel danışma için Scripps Araştırma Enstitüsü (La Jolla, CA) Marnie Fusco, Dafna Abelson ve Dr Erica Ollmann Saphire teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
Referências
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
