Wholemount Immunohistokemi för att avslöja Complex Brain Topography

Summary

Nervbanor är topografiskt organiserade i funktionella fack med specifika molekylära profiler. Här ger vi de praktiska och tekniska åtgärder för att avslöja den globala hjärnan topografi med hjälp av en mångsidig wholemount immunhistokemisk färgning strategi. Vi demonstrerar användbarheten av metoden med användning av väl förstått cellarkitekturen och kretsarna i lillhjärnan.

Abstract

Den upprepade och väl förstod cellulär arkitektur lillhjärnan gör det till en idealisk modell för att utforska hjärnan topografi. Bakom den relativt enhetliga cellarkitekturen är en komplex uppsättning parasagittal domäner gen-och proteinuttryck. Den molekylära uppdelning av lillhjärnan speglas av anatomiska och funktionella organisation afferenta fibrer. För att till fullo uppskatta komplexiteten i lillhjärnan organisation vi förfinat tidigare en wholemount färgning metod för hög genomströmning analys av mönstring defekter i musen lillhjärnan. Detta protokoll beskriver i detalj de reagens, verktyg och praktiska åtgärder som är användbara för att framgångsrikt avslöja mönster proteinuttryck i den vuxna möss lillhjärnan med wholemount immunfärgning. De steg som lyfts fram här visar nyttan av denna metod att använda uttrycket av zebrinII / aldolaseC som ett exempel på hur den fina topografi hjärnan kan avslöjas i sinnativa tredimensionella konformation. Också beskrivet är anpassningar till protokollet att möjliggöra visualisering av proteinuttryck i afferenta prognoser och stora cerebella för jämförande studier av molekylära topografi. För att illustrera dessa program är data från afferenta färgning av råttcerebellum ingår.

Protocol

1. Animal perfusion och Cerebellum Dissection Beroende på proteinet, kan perfusion vara avgörande för en framgångsrik färgning 1,2. Transkardial perfusion är en invasiv och icke-överlevnad förfarande som kräver en korrekt användning av bedövningsmedel. Korrekt utbildning, institutionella godkännande och lACUC godkännande är alla nödvändiga innan proceduren. Det är alltid en god idé att konsultera institutionens veterinärer för att få hjälp att identifiera experimentella krav o…

Discussion

Vi har beskrivit de tekniska uppgifter som krävs för en lyckad wholemount färgning med hjälp av en mångsidig immunhistokemisk metod för avslöjande protein uttryck i utvecklande och vuxna hjärnan. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan komplexa molekylära uttryck mönster analyseras och hjärnan topografi uppskattade utan mödosamma och tidskrävande vävnad snittning.

Detta protokoll har använts för att avslöja den mönstrade uttrycket av flera Purkinje cellproteiner i…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.