Måling cellecyklusprogression Kinetics med metabolisk mærkning og Flowcytometri
Summary
Sporing små ændringer i progression og kinetikken af cellecykluskinaser trin kan udføres ved anvendelse af en kombination af metabolisk mærkning af nukleinsyrer med BrdU og totalt genomisk DNA-farvning via propidiumiodid. Denne fremgangsmåde undgår behovet for kemisk synkronisering af delende celler, og derved forhindre indførelse af ikke-specifik DNA-skade, som igen påvirker cellecyklusprogression.
Abstract
Præcis kontrol af indledningen og den efterfølgende progression gennem de forskellige faser af cellecyklus er af afgørende betydning i prolifererende celler. Cellecyklus division er en integreret del af vækst og reproduktion og deregulering af centrale cellecyklus komponenter er blevet impliceret i den udløsende begivenheder carcinogenese 1,2. Molekylære agenter i anti-cancer behandlinger ofte målrette biologiske veje, der er ansvarlige for regulering og koordinering af cellecyklus division 3. Selv cellecykluskinetikken tendens til at variere efter celletype, fordelingen af celler blandt de fire stadier af cellecyklen, er temmelig ensartet i en bestemt cellelinie skyldes konsistent mønster af mitogen-og vækstfaktor-ekspression. Genotoksiske begivenheder og andre cellulære stressfaktorer kan resultere i en midlertidig blokering af cellecyklus, hvilket resulterer i arrest eller en midlertidig pause i en bestemt celle cyklus fase for at tillade institutionergelse af en passende reaktion mekanisme.
Evnen til at eksperimentelt observere opførslen af en cellepopulation med henvisning til deres cellecyklus fase er et vigtigt fremskridt i cellebiologi. Almindelige fremgangsmåder, såsom mitotiske ryste, differentialcentrifugering eller flowcytometri-baserede sortering anvendes til at isolere celler på specifikke stadier af cellecyklen 4-6. Disse fraktionerede, cellecyklusinhibitorer fase-berigede populationer underkastes derefter eksperimentelle behandlinger. Udbytte, renhed og levedygtigheden af de separerede fraktioner kan ofte blive kompromitteret ved hjælp af disse fysiske adskillelsesmetoder. Samt, kan tidsforskydningen mellem adskillelse af de cellepopulationer og starten af eksperimentel behandling, hvor de fraktionerede cellerne kan udvikle sig fra den markerede celle cyklus fase, udgør store udfordringer i den vellykkede gennemførelse og fortolkning af disse eksperimenter.
Andre metoder til study cellecykluskinetikken trin omfatter anvendelsen af kemikalier til at synkronisere celler. Behandling af celler med kemiske inhibitorer af vigtige metaboliske processer til hver celle cyklus trin er nyttige til blokering af progression af cellecyklus til det næste trin. For eksempel begrænser ribonucleotidreduktaseinhibitorforbindelser hydroxyurinstofforbindelser Standsningssteder celler ved G1 / S tidspunkt ved tilførsel af deoxynukleotider, byggestenene i DNA. Andre bemærkelsesværdige kemikalier omfatter behandling med aphidicolin, en polymerase alpha inhibitor for G1 arrestation behandling med colchicin og nocodazol, som begge interferere med mitotiske spindel dannelse standse celler i M-fasen, og endelig behandling med DNA kædeterminator 5-fluorodeoxyridine initiere S-fase arrest 7-9. Behandling med disse kemikalier er et effektivt middel til synkronisering af en hel population af celler i en bestemt fase. Med fjernelse af de kemiske, genforenes celler cellecyklussen i fællesskab. Behandling af testmidlet følgende frigivelsefra cellecyklussen blokerende kemisk sikrer, at lægemidlet, der fremkaldes er af en ensartet, cellecyklus fase-specifik population. Men er da mange af de kemiske synchronizers kendte genotoksiske forbindelser, driller hinanden deltagelse af forskellige modforanstaltninger veje (til synchronizers versus test agenter) er udfordrende.
Her beskriver vi en metabolisk mærkning fremgangsmåde til efter en subpopulation af aktivt delende celler via deres progression fra DNA-replikation fase igennem til deling og adskillelse af de datterceller. Koblet med flowcytometri kvantificering denne protokol muliggør til måling af kinetiske progression af cellecyklus i fravær af enten mekanisk eller kemisk induceret cellulære understreger almindeligvis forbundet med andre cellecykluskinaser synkronisering metoder 10. I de følgende afsnit vil vi diskutere metoden, samt nogle af dens anvendelser inden for biomedicinsk forskning.
Protocol
Discussion
Ved at kombinere flowcytometri med BrdU inkorporering, har vi de nødvendige værktøjer til at undersøge celle cyklus kinetik. Den karakteristiske egenskab af BrdU at fungere som en thymidinanalogen er det muligt for DNA-indhold kvantificering af en cykel celle. Inkorporering af BrdU i en voksende datter DNA-streng under syntesen fase af cellecyklen, er det, gør det muligt at følge en subpopulation af delende celler ved replikation af DNA i S-fase, en periode af væksten ved G2 og i sidste celledeling . Datterceller…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andy Johnson fra Biomedical Research Center ved UBC for at få hjælp med FACS analyse. Cancer Research Funding i Wong Laboratory leveres af den canadiske Cancer Society Research Institute (driftstilskud # 019.250) og fra Research for geninvestering midler fra Det Farmaceutiske Fakultet, UBC. JMYW er støttet af Canada Research stole og Michael Smith fundament for sundhed forskningskarriere udviklingsprogrammer.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
Referências
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
