Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri
Summary
Spårning subtila förändringar i progression och kinetiken av stegen cellcykelns kan åstadkommas genom användning av en kombination av metabolisk märkning av nukleinsyror med BrdU och totalt genomiskt DNA-färgning via propidiumjodid. Denna metod undviker behovet av kemisk synkronisering av cyklande celler, vilket därigenom förhindrar införandet av icke-specifik DNA-skada, vilket i sin tur påverkar cellcykelprogressionen.
Abstract
Exakt kontroll av initiering och efterföljande progression genom de olika faserna i cellcykeln är av största betydelse i prolifererande celler. Cellcykeln division är en integrerad del av tillväxt och reproduktion och avregleringen av nyckelkomponenter cellcykelns har varit inblandade i de utfällda händelser cancer 1,2. Molekylära agenter i cancerbehandlingar rikta ofta biologiska vägar som ansvarar för reglering och samordning av cellcykeln Division 3. Även om cellcykelns kinetik tenderar att variera beroende på celltyp, är fördelningen av celler mellan de fyra stegen av cellcykeln ganska överens med en viss cellinje på grund av konsekvent mönster för mitogen och tillväxtfaktor uttryck. Genotoxiska händelser och andra cellulära stressorer kan resultera i en temporär blockering av cellcykelprogression, vilket resulterar i gripande eller en temporär paus i en särskild cell cykel fas för att möjliggöra institurandet av lämpliga svarsmekanism.
Förmågan att experimentellt observera uppträdandet av en cellpopulation med hänvisning till deras cellcykelprogression steget är ett viktigt framsteg inom cellbiologi. Gemensamma förfaranden som mitotisk skaka, differentiell centrifugering eller flödescytometri-baserad sortering används för att isolera celler i vissa stadier av cellcykeln 4-6. Dessa fraktionerade, cellcykelinhibitorer fas-berikade populationer utsätts sedan för experimentella behandlingar. Utbyte, renhet och livskraften hos de separerade fraktionerna kan ofta försämras med användning av dessa fysikaliska separationsmetoder. Som väl kan tiden mellan separation av cellpopulationer och i början av experimentell behandling, varvid de fraktionerade cellerna kan utvecklas från den valda cellcykeln skede innebära stora utmaningar i den framgångsrika genomförandet och tolkningen av dessa experiment.
Andra metoder för study cellcykelns steg innefattar användning av kemikalier för att synkronisera cellerna. Behandling av cellerna med kemiska inhibitorer av viktiga metaboliska processer för varje cellcykelsteget är användbara vid blockering av progressionen av cellcykeln till nästa steg. Till exempel inhiberar ribonukleotidreduktas hydroxiurea stoppar celler vid G1 / S skede genom att begränsa utbudet av deoxinukleotider, de byggstenar av DNA. Andra anmärkningsvärda kemikalier innefattar behandling med afidikolin, att en polymeras-alfa-hämmare för G1 gripande, behandling med kolchicin och nokodazol, vilka båda påverkar mitotiska spolen bildning stoppa celler i M-fasen och slutligen, att behandling med DNA-kedjeterminator 5-fluorodeoxyridine initiera S fasstillestånd 7-9. Behandling med dessa kemikalier är ett effektivt sätt att synkronisera en hel population av celler vid en viss fas. Med avlägsnande av det kemiska, celler återförenas cellcykeln unisont. Behandling av testmedlet följande frisättningfrån cellcykeln blockerande kemisk säkerställer att läkemedlet som framkallades är från en enhetlig, cellcykelsteget-specifik population. Dock eftersom många av de kemiska synkroniseringsdon kända genotoxiska föreningar, retas isär deltagande av olika motåtgärder vägar (till synkroniseringsdon kontra de test medel) är en utmaning.
Här beskriver vi en metabolisk märkning metod för att följa en subpopulation av aktivt delande celler genom sin utveckling från DNA-replikation fasen, fram till uppdelningen och separation av deras dotter celler. Tillsammans med flödescytometri kvantifiering, gör detta protokoll för mätning av kinetisk progression av cellcykeln i frånvaro av antingen mekaniskt eller kemiskt inducerad cellulär betonar vanligen förknippas med andra synkronisering cellcyklens metoder 10. I de följande avsnitten kommer vi att diskutera metoder, samt några av dess tillämpningar inom biomedicinsk forskning.
Protocol
Discussion
Genom att kombinera flödescytometri med BrdU inkorporering, har vi de nödvändiga verktygen för att studera cellcykelkinetiken. Den utmärkande egenskapen av BrdU att fungera som en tymidinanalog är vad som möjliggör för DNA-innehåll kvantifiering av en cykel cell. Inkorporeringen av BrdU i en växande dotter-DNA-strängen under syntesen fasen av cellcykeln är det som tillåter en att följa en subpopulation av cyklande celler genom replikering av DNA i S-fas, till en period av tillväxt vid G2 och slutligen ti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Andy Johnson av Biomedicinskt Research Center vid UBC för hjälp med FACS analys. Cancer Research finansiering i Wong laboratoriet tillhandahålls av den kanadensiska Cancerfonden Research Institute (driftsbidrag # 019.250) och från forskning Återinvesteringen medel från fakulteten Pharmaceutical Sciences, UBC. JMYW stöds av Kanada forskning ordförande och Michael Smith Stiftelsen för hälsoutveckling forskarkarriär program.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
Referências
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
