Diffuse fluorescens tomografi tilbyr en relativt lav pris og potensielt høy gjennom tilnærming til preklinisk<em> In vivo</em> Tumor bildebehandling. Metodikken av optiske datainnsamling, kalibrering, og bilde rekonstruksjon presenteres for en computertomografi-guidet berøringsfri tid-domene-systemet med fluoriserende målretting av svulsten biomarkør epidermal vekstfaktorreseptor i en mus glioma modell.
Liten dyr fluorescens molekylær imaging (FMI) kan være et kraftig verktøy for preklinisk medisiner og utviklingsstudier 1. Men begrenser lys absorpsjon av vev chromophores (f.eks hemoglobin, vann, lipider, melanin) typisk optisk signal forplantning gjennom tykkelser større enn noen få millimeter 2. Sammenlignet med andre synlige bølgelengder, vev absorpsjon for rødt og nær-infrarødt (nær-IR) lys absorpsjon dramatisk reduserer og ikke-elastisk spredning blir dominerende lys-vev interaksjon mekanisme. Den relativt ny utvikling av fluorescerende stoffer som absorberer og avgir lys i nær-IR rekkevidde (600-1000 nm), har drevet utvikling av imaging-systemer og lette forplantning modeller som kan oppnå hele kroppen tre-dimensjonal avbildning i små dyr 3.
Til tross for store fremskritt i dette området forblir dårlig stilt natur diffus fluorescens tomografi en betydeligproblem for stabiliteten, kontrast utvinning og romlig oppløsning på bildet gjenoppbygging teknikker og den optimale tilnærming til FMI i små dyr er ennå ikke avtalt. Flertallet av forskningsmiljøer har investert i charge-coupled device (CCD)-baserte systemer som gir rikelig vev-sampling men suboptimal følsomhet 4-9, mens vår gruppe og noen få andre 10-13 har fulgt systemer basert på svært høy følsomhet detektorer , at på dette tidspunktet tillater tett vev prøvetaking for å bare oppnås på bekostning av lav bildebehandling gjennomstrømning. Her kan vi demonstrere metodikk for å søke ett foton oppdagelsen teknologien i en fluorescens tomografi system for å lokalisere en cancerous hjerne lesjon i en mus modell.
Fluorescens tomografi (FT) system ansatt enkelt foton telle med photomultiplier rør (PMT) og informasjons-rik tid-domene Light Detection i en ikke-kontakt konformasjon 11. Dette gir en simultan collection for overført eksitasjon og utslipp lys, og inkluderer automatisk fluorescens eksitasjon eksponeringskontroll 14, laser referering, og co-registrering med et lite dyr computertomografi (microCT) system 15. En naken mus modell ble brukt for bildebehandling. Dyret ble inokulert orthotopically med et menneskelig glioma cellelinje (U251) i venstre cerebrale hemisfære og avbildes 2 uker senere. Svulsten ble laget for å fluoresce ved å injisere et fluorescerende sporstoff, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) rettet mot epidermal vekstfaktorreseptor, en cellemembran protein kjent for å være overexpressed i U251 tumor linje og mange andre kreftformer 18. En annen, vilkårlige fluorescerende sporstoff, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) ble også injisert å ta hensyn til ikke-reseptor medierte effekter på opptaket av de målrettede sporstoff for å gi et middel for å kvantifisere tracer bindende og reseptor tilgjengelighet / tetthet 27. En CT-veiledet, tIME-domene algoritme ble brukt til å rekonstruere plasseringen av både fluorescerende sporstoff (dvs. plasseringen av svulsten) i mus hjernen og deres evne til å lokalisere svulsten ble bekreftet av Kontrastforsterket magnetisk resonans imaging.
Selv demonstrert for fluorescens bildebehandling i en glioma mus modell, kan metodikken presenteres i denne videoen bli utvidet til forskjellige tumormodeller i diverse små dyremodeller potensielt opp til størrelsen av en rotte 17.
Fluorescens tomografi (FT) er en følsom, ioniserende stråling gratis molekylær imaging modalitet basert på synlig og nær-infrarødt lys transport gjennom biologisk vev. Mesteparten av interessen i FT har vært fokusert på dens potensial til å fremskynde medisiner og utvikling i små dyr eksperimentelle modeller 1 og en sentralt område av forskningen har vært å studere kreft biomarkør uttrykk og respons på molekylære terapier 26. I dag er det to konkurrerende tilnærminger til FT system design. Den vanligste design er basert på avkjølte charge-coupled enhet (CCD) kamera for fluorescens deteksjon 4-9. Denne designen gir en høy tetthet av målinger, maksimere vev prøvetaking siden hver piksel i CCD kameraet kan oppdage lyset som har reist en unik bane gjennom vevet. Men CCD-kameraer har et begrenset dynamisk område og lese-out støygrenser deres ultimate følsomhet. Den andre unngår potensielle begrensninger sjoner av CCD-kamera deteksjon ved å benytte svært følsom single-foton telling teknologi basert på bruk av slike detektorer som photomultiplier rør eller rasfarlige fotodioder 10-13. Ulempen med disse mer sensitive deteksjonsmetoder er at hver detektor kan bare samle lys på ett punkt, og derfor for å oppnå tett vev prøvetaking, enten mange detektorer må brukes (som er veldig dyrt), eller mange anslag må avbildes med samme detektor (som kan være tidkrevende). Mens optimalt nivå av vev prøvetaking for små dyr FT ikke er avtalt, og kan variere fra sak til sak, er det avtalt at single-foton telling instrumenteringen er bedre egnet til å utforske følsomheten grensene for FT i form av sin evne til å oppdage lave konsentrasjoner av molekylære markører. I denne studien, gir vi en metodikk for gjennomføring av FT bruker single-foton telling deteksjon instrumentering å lokalisere svulster i mus.
ent "> Det er fire viktige trinn er involvert for å produsere robuste datasett med tid-korrelerte singel-foton telle FT. Den første er bruken av en egnet og grei kalibreringsprosedyren. I presenterte metodikken, er de respektive sensitiviteten for hver deteksjon kanal utgjorde for ved å samle en baseline måling av eksitasjon lys sendes gjennom en linje-diffusor utformet for å lede like fraksjoner av lys til hver detektor 15. Videre er oppdaget lyset under et eksperiment kontinuerlig kalibrert til laser referanse, både når det gjelder intensitet og betyr . gang, noe som kan variere over tid, ved drift av en laser referanse kanal 11,15 Den andre kritiske trinnet er nøyaktig innsamling og co-registrering av anatomiske bildebehandling for guidede fluorescens rekonstruksjoner FT data alene gir ingen anatomisk informasjon.; Derfor, for å lage en modell av lys transport som kan brukes til å rekonstruere losering av fluorescerende kilder i et eksemplar fra den oppdaget fluorescens på overflaten av prøven, må anatomi av prøven i forhold til FT systemet nøyaktig kjent. I vårt system er anatomisk informasjon ervervet ved en mikro-computertomografi system med romlige koordinater som er romlig registrert med de av FT system 15,20. Den tredje kritiske trinnet innebærer at en optimal eksponering (dvs. total foton deteksjon tid for hver laser projeksjon) er ansatt ved hver kilde-detektoren er plassert. Dette er viktig av to grunner: for det første å sikre at det er tilstrekkelig signal-til-støy ved hver detektering posisjon og andre for å unngå detektor metning, som kan skade de deteksjons enhetene. For å oppnå optimal eksponering ved hver detektor posisjon, er en automatisk eksponeringskontroll ansatt som triangulates hovedsak den optimal eksponering fra to, lav-signal eksponeringer 14. Den fjerde kritisketrinn i metodikken refererer til de innsamlede fluorescens data til mengden av overførte eksitasjon lys. Dette referering kalles ofte Født forholdet, og gir mange fordeler for FT, med det viktigste man være en reduksjon av modell-data mismatch feil 23,24. Den presenterte systemet ble utviklet for å oppdage både fluorescens og sendt eksitasjon lys samtidig ved å kanalisere lyset i hvert deteksjon kanal inn i 2 separate photomultiplier rør. Ved å gjøre dette unngår vi eventuelle effekter av bevegelse på nøyaktigheten av Born forholdet.Med en robust datasett det hånd, innebærer bilde rekonstruksjon av tid-domene data løse den inverse problemet med elementmetoden mesh ha uttrykket:
d = Jx
der d er en vektor med n x m elementer for n kilde-detektor anslag og m TPSF tid porter, J er en n x m-by-l følsomhet matrise (eller Jacobian), for l noder i mesh, og x er vektor av fluorescens optiske egenskapene i hver node, har størrelse L d er de kalibrerte data samlet inn under eksperimentet og J er simulert ved hjelp av elementmetoden løsningen. til tidspunktet domenet spredning tilnærming av fluorescens transport 25. Den tid-dimensjonen J er også convolved med detektoren spesifikke instrument respons funksjoner. X er en representasjon av fluorescens kartet av renter og løses for å bruke en Levenberg-Marqardt ikke-negativ minste kvadraters metode med Tikhonov regularisering 15.
Metodikken som presenteres her, som beskriver en prosedyre i stand til å lokalisere fluorescensmerkede svulster i mus ved hjelp av svært sensitive foton telle fluorescens deteksjon, har potensial til å presse grensene for FT. I en tidligere studie, potensialet for å ansette dennetilnærmingen i større-enn-mus dyr modeller, for eksempel rotter, samt økt følsomhet over eksisterende system design i mus-sized prøvene, ble demonstrert 17. Den umiddelbare anvendelsen av denne tilnærmingen ville være for overvåking av biomarkør uttrykk in vivo i små dyr tumormodeller å vurdere legemidlets effekt i en high-throughput midler. Muligheten av systemet for å opphisse og oppdage fluorescens på flere bølgelengder gir samtidig påvisning av flere fluorescerende markører. Ytterligere fluorescerende markører gi et middel for å forhøre flere aspekter av en patologi, samtidig, eller kan brukes, som i denne studien, for å ansette flere kvantitative tenkelig tilnærminger som dual-reporter metoder for å måle in vivo bindende potensial, en markør av reseptor tetthet 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har vært finansiert av National Cancer Institute bevilgninger R01 CA120368 og R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) og K25 CA138578 (FL), og kanadiske Institutes of Health Research postdoktorstipend award (KMT ). Utviklingen av fluorescens tomografi systemet ble delvis finansiert via Avanserte Forskning Technologies (Montreal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |