Diffus fluorescens tomografi erbjuder en relativt låg kostnad och potentiellt hög hela inställning till preklinisk<em> In vivo</em> Tumöravbildning. Den metod för optisk datainsamling, kalibrering och bildrekonstruktion presenteras för en datortomografi-styrda icke-kontakt time-domain system med fluorescerande inriktning av tumören biomarkörer receptorn för epidermal tillväxtfaktor i en mus gliom modell.
Small Animal fluorescens molekylär avbildning (FMI) kan vara ett kraftfullt verktyg för preklinisk läkemedelsutveckling och studier utveckling 1. Begränsar dock ljusabsorption av vävnadsinrättningar kromoforer (t.ex. hemoglobin, vatten, lipider, melanin) vanligtvis optisk signal utbredning genom tjocklekar större än några millimeter 2. Jämfört med andra synliga våglängder, vävnad absorptions för rött och infrarött (nära-IR) Ijusabsorption dramatiskt minskar och icke-elastisk spridning blir den dominanta ljus-vävnad interaktion mekanism. Den relativt sena utvecklingen av fluorescerande medel som absorberar och avger ljus i det nära IR-området (600-1000 nm) har drivit utvecklingen av bildsystem och lätta modeller förökning som kan uppnå hela kroppen tredimensionell avbildning i små djur 3.
Trots stora framsteg på detta område förblir illa ställt natur diffus fluorescens tomografi en betydandeproblem för stabiliteten, kontrast återhämtning och rumsliga upplösningen av tekniker bildrekonstruktion och optimala lösningen för FMI i små djur har ännu inte kommit överens om. Majoriteten av forskargrupper har investerat i charge-coupled device (CCD)-baserade system som ger rikligt vävnads-sampling, men suboptimal sensitivitet 4-9, medan vår grupp och några andra 10-13 har drivit system baserade på mycket hög känslighet detektorer att vid denna tidpunkt att tät vävnad provtagning kan endast uppnås på bekostnad av låg avbildning genomströmning. Här visar vi en metod för att tillämpa en-foton-detekteringsteknik i en fluorescens tomografi system för att lokalisera en cancerartad hjärnskada i en musmodell.
Fluorescensen tomografi (FT) system som används enstaka fotonräknande med fotomultiplikatorrör (PMT) och informationsrik time-domain detektering av ljus i en icke-kontakt konformation 11. Detta ger en samtidig colling av överförd excitation och emission ljus, och inkluderar automatisk fluorescenskontroll excitation exponering 14, laser referenser, och co-registrering ett litet djur datortomografi (microCT) system 15. En naken musmodell användes för avbildning. Djuret ympades ortotopiskt med en mänsklig gliom cellinje (U251) i vänster hjärnhalva och avbildas 2 veckor senare. Tumören har gjorts för att fluorescera genom insprutning av en fluorescerande spårämne, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) riktade mot receptorn för epidermal tillväxtfaktor, en cellmembranprotein känt att vara överuttryckt i U251 tumörlinje och många andra cancerformer 18. En andra, oriktade fluorescerande spårämne, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) injicerades också att ta hänsyn för icke-receptormedierade effekter på upptaget av de riktade spårämnen för att ge ett medel för att kvantifiera spårämne bindning och receptor tillgänglighet / täthet 27. En CT-guidad, tIME-domänen algoritm användes för att rekonstruera den plats både fluorescerande spårämnen (dvs. placeringen av tumören) i mushjärna och deras förmåga att lokalisera tumören bekräftades genom kontrastförstärkt magnetisk resonanstomografi.
Även visat för fluorescens avbildning i en gliom musmodell, kan den metod som presenteras i denna video utökas till olika tumörmodeller i olika små djurmodeller eventuellt upp till storleken av en råtta 17.
Fluorescens tomografi (FT) är en känslig, joniserande strålning utan molekylär avbildning modalitet baserade på synliga och nära infraröda ljuset transport genom biologisk vävnad. Det mesta av intresset för FT har fokuserat på dess potential att påskynda läkemedelsutveckling och utveckling i små djurexperimentella modeller 1 och ett mycket viktigt område för forskningen har varit att studera cancer biomarkör uttryck och reaktion på molekylära behandlingar 26. För närvarande finns det två konkurrerande metoder för FT-system design. Den vanligaste konstruktionen är baserad på kylda charge-coupled device (CCD) kameror för fluorescensdetektion 4-9. Denna utformning ger en hög täthet av mätningar, vilket maximerar vävnadsprovtagning eftersom varje pixel i CCD-kameran kan detektera ljus som har färdats en unik väg genom vävnaden. Men CCD-kameror har en begränsad dynamiskt omfång och avläsning brus begränsar deras slutliga känslighet. Den andra konstruktionen undviker potentiell begränsning tioner av CCD-kameran detektering genom användning av mycket känsliga enda fotonräkning teknik baserad på användningen av sådana detektorer som fotomultiplikatorrör eller fotodioder lavin 10-13. Nackdelen med dessa mer känsliga metoder för detektering är att varje detektor endast kan samla ljus vid en enda punkt, och därför att åstadkomma tät vävnad provtagning, antingen många detektorer måste användas (vilket är mycket dyr) eller många utsprång måste avbildas med samma detektor (som kan vara tidskrävande). Medan den optimala nivån av vävnad provtagning för små djur FT inte har avtalats, och kan variera från fall till fall, är det överenskommet att enda fotonräkning instrumentering bättre lämpad att utforska känslighet gränserna för FT i form av sin förmåga att detektera låga koncentrationer av molekylära markörer. I denna studie ger vi en metod för att genomföra FT med single-photon instrumentering räknar upptäckt att lokalisera tumörer hos möss.
ENT "> Det finns fyra viktiga stegen för att producera robusta dataset med tidskorrelerade enda fotonräknande FT. Den första är tillämpningen av en lämplig och enkel kalibrering. I den presenterade metoden är respektive känslighet för varje detekteringskanal svarade för uppsamling av en baslinjemätning av excitationsljus som sänds genom en linje-diffusor utformad för att rikta lika stora fraktioner av ljus till varje detektor 15. Vidare är det detekterade ljuset vid ett experiment kontinuerligt kalibreras för att lasern referens, i termer av både intensitet och medelvärdet .-tid, vilket kan variera över tiden, genom användning av en laser referenskanalen 11,15 Det andra kritiska steget är korrekt insamling och sam-registrering av anatomisk avbildning för guidade fluorescens rekonstruktioner FT uppgifter enbart erbjuder ingen anatomisk information. Därför, för att skapa en modell av ljus transport som kan användas för att rekonstruera den lokatjon av fluorescerande källor inom ett prov från den detekterade fluorescensen vid ytan av provet, måste anatomi av provet i förhållande till FT systemet vara exakt känd. I vårt system är den anatomiska information som inhämtats genom en mikro-datortomografi system med rumsliga koordinater som har rumsligt registrerats med dem i FT-systemet 15,20. Det tredje kritiska steget innebär att säkerställa att en optimal exponering (dvs. totalt fotondetektering tid för varje laser projektion) är anställd vid varje källa-detektor position. Detta är viktigt av två skäl: För det första att se till att det finns tillräckligt med signal-till-brus vid varje upptäckt läget och andra att undvika detektorn mättnad, vilket kan skada upptäckt enheterna. För att uppnå optimal exponering vid varje detektor läge, en automatisk exponeringskontroll anställd som i huvudsak triangulates optimal exponering från två låg signal exponeringar 14. Den fjärde kritiskasteg av metoden refererar de uppsamlade fluorescensdata till mängden överförda excitationsljus. Detta referenser kallas ofta Född förhållandet, och ger många fördelar för FT, med den viktigaste är en minskning av modell-data oöverensstämmelsefel 23,24. Det presenterade systemet utformades för att detektera både fluorescens-och sänd excitationsljus samtidigt genom att kanalisera ljuset i varje detekteringskanal i 2 separata fotomultiplikatorrör. Genom att göra detta undviker vi några effekter av rörelse på noggrannheten i Born förhållandet.Med en robust datamängd det sidan innebär bildrekonstruktion tid-domän uppgifter att lösa inversa problemet med finita element nät med uttrycket:
d = Jx
där d är en vektor med n x m element för n källa-detektor utsprång och m TPSF tid grindar; J är en n x m-för-l känslighet matrix (eller Jacobian), för l noder i nätet, och x är vektorn av fluorescens optiska egenskaper i varje nod, med storlek L d är de kalibrerade data som samlas in under experimentet och J simuleras med hjälp av finita element lösningen. till tidsdomänen diffusion tillnärmning av fluorescens transportmedel 25. Den tids-dimension J också faltad med detektorn specifika funktioner instrumentets respons. Är en representation av fluorescens karta av intresse och löses för att använda en Levenberg-Marqardt icke-negativ minsta kvadratmetoden tillvägagångssätt med Tikhonov reglering 15 x.
Den metod som presenteras här, som beskriver en process som kan lokalisera fluorescensmärkta tumörer i möss med hjälp av mycket känsliga fotonräknande fluorescensdetektering, har potentialen att pressa gränserna för FT. I en tidigare studie, den potential som använder dennatillvägagångssätt i större än möss djur modeller, såsom råttor, samt förbättrad känslighet över befintliga systemet mönster i mus-storlek prover, visades 17. Omedelbar tillämpning av denna metod skulle vara för övervakning av biomarkörer uttryck in vivo i små djurtumörmodeller att bedöma läkemedlets effektivitet i en hög genomströmning medel. Förmågan hos systemet att excitera och detektera fluorescens vid multipla våglängder tillåter samtidig detektion av flera fluorescerande markörer. Ytterligare fluorescerande markörer ger ett medel för att förhöra flera aspekter av en patologi, samtidigt, eller kan användas, som i denna studie, att anställa fler kvantitativa imaging metoder såsom dubbla reporter metoder för att mäta in vivo bindningen potential, en markör för receptortäthet 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av National Cancer Institutes bidrag R01 CA120368 och R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) och K25 CA138578 (FL), och kanadensiska Institutes of Health Research postdoktorsstipendium Award (KMT ). Utvecklingen av fluorescensen tomografi systemet delvis finansierats av Advanced Research Technologies (Montreal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |