Immunhistokjemisk farging av B7-H1 (PD-L1) på parafin-embedded lysbilder av bukspyttkjertelen Adenocarcinoma Tissue
Summary
B7-H1 (PD-L1) og dens binding til PD-1 gi et stort tumorindusert immunsuppressivt signal i svulsten mikromiljøet. En immunhistokjemisk farging teknikk for å karakterisere uttrykk og lokalisering av B7-H1 i bukspyttkjertelen adenokarsinom er beskrevet her.
Abstract
B7-H1/PD-L1, et medlem av familien av B7 immun-regulerende celle-overflateproteiner, spiller en viktig rolle i den negative regulering av celle-medierte immunresponser gjennom et samspill med sin reseptor, programmert død-1 (PD -1) 1,2. Overuttrykte B7-H1 av tumorceller har blitt bemerket i en rekke humane kreftformer, inkludert melanom, glioblastoma, og karsinomer i lunge, bryst, tykktarm, eggstokk og renale celler, og har vist seg å påvirke anti-tumor-T- celle immunitet 3-8.
Nylig har B7-H1 uttrykk ved bukspyttkjertelen adenokarsinom vev blitt identifisert som en potensiell prognostisk markør 9,10. Tillegg har blokade av B7-H1 i en musemodell av bukspyttkjertelkreft vist seg å produsere en anti-tumorrespons 11. Disse dataene antyder viktigheten av B7-H1 som et potensielt terapeutisk mål. Anti-B7-H1 blokade antistoffer derfor blir testet i kliniske studier for multiple menneskelige solide tumorer inkludert melanom og kreft i lunge, tykktarm, nyrer, mage og bukspyttkjertel 12.
For til slutt kunne identifisere de pasientene som vil dra nytte av B7-H1 målretting terapi, er det avgjørende å undersøke sammenhengen mellom uttrykk og lokalisering av B7-H1 og pasientens respons på behandling med B7-H1 blokade antistoffer. Undersøke uttrykk for B7-H1 i menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom vev gjennom immunhistokjemi vil gi en bedre forståelse av hvordan dette samarbeidet hemmende signalering molekyl bidrar til undertrykkelse av antitumor immunitet i svulsten mikromiljøet. Den anti-B7-H1 monoklonalt antistoff (klon 5H1) utviklet av Chen og medarbeidere har vist seg å produsere pålitelig flekker resultater i cryosections av flere typer humane neoplastiske vev 4,8, men misfarging på parafin-embedded lysbilder hadde vært en utfordring til nylig 13-18. Vi har devrømte B7-H1 farging protokoll for parafin-embedded lysbilder av bukspyttkjertelen adenokarsinom vev. B7-H1 flekker protokollen beskrevet her produserer konsekvent membran og cytoplasmisk farging av B7-H1 med litt bakgrunn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunhistokjemisk farging av B7-H1 på cryosections har blitt rapportert i tidligere studier for en rekke kreftformer 3,4. Men kliniske tumorprøver vanligvis er bare tilgjengelig i form av parafin-embedded blokker. Den 5H1 monoklonalt antistoff har mer nylig blitt brukt til farging av parafin innebygde tumorvev inkludert nyrecellekarsinom, cervical carcinoma, blærekreft og melanom 13-18. B7-H1 flekker på parafin-embedded 9,19 eller kryostaten 20 deler av bukspyttkjertelen a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EB, KMB, og HX bidrar like mye. Denne studien ble støttet av NCI SPORE i gastrointestinal kreft P50 CA062924, NIH CA148964 K23, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Opplæring Grant, Sol Goldman Bukspyttkjertelkreft Center, og National Pancreas Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. |
Referências
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
- Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
- Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
- Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
- Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
- Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
- Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
- Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
- Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
- Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
- Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
- Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
- Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
- Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
- Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
- Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
- Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
- Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
- Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
- Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).
